ES Cell-derivati ​​colture cellulari neuroepiteliale

Fase 1

1. Piastra mitomicina-C ggrowth inibito (10 mg / ml per 2,5 ore) MS5 cellule ad una densità di 70.000 / cm2 di gelatina rivestita (0,01% per 30 minuti) 6 piastre in α-MEM media.
2. Quando le cellule sono collegate e hanno formato un monostrato (oltre crescita notte), passare a SRM.
3. Manualmente isolare colonie di cellule ES da colture di cellule ES usando una siringa con un ago 27 ½ G.
4. Tritrurate le colonie accuratamente con una punta di 1 ml di blu e la piastra a bassa densità sul MS5 cellule (di solito 2-3 colonie per 6 pozzetti).

Nota: Le cellule ES possono anche essere prelevati da propagazione enzimatica con collagenasi e tripsina.

Fase 2

1. Crescere le cellule ES sul MS5 alimentatori per 14-21 giorni fino a rosetta contenenti formano colonie.

Nota: i media cambiano spesso. Le rosette sono di solito ai bordi esterni delle colonie e la loro formazione può essere notevolmente migliorata se 300-500 ng / ml Noggin viene aggiunto al SRM (3). In alcuni protocolli di differenziazione, SRM possono essere scambiati con N2-A media e integrata con altri fattori di crescita o di promuovere specifiche cellule (2-5).

Fase 3

1. Isolare e scegliere le rosette con un 27 ½ ago G al microscopio.

Nota: Evitare di tagliare e scegliere i MS5 cellule stromali. Se le colonie sono pieni di rosette, si può anche isolare l'intera colonia.

Fase 4

1. Aspirare il cluster di rosette, li tritrurate accuratamente con una punta di 1 ml blu, e la piastra li poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) rivestita 6 pozzi in N2-Una media di solito integrati con bFGF (20 ng / ml). Le rosette si riforma e si espandono.

Nota: per migliorare la sopravvivenza delle cellule, si possono piatto i cluster di piccole gocce di aumentare la densità delle cellule. Questa fase può anche essere modificata, che completa l'N2-A media con un'ulteriore crescita o altri fattori di promuovere la specificazione delle cellule (2-5).

Questo protocollo mostra le diverse fasi di generazione e isolare le cellule neuroepiteliale da cellule staminali embrionali umane usando SDIA. L'applicazione di questo metodo è molteplice ed è stato utilizzato in molti protocolli di produrre neuroni specificato (ad esempio 1, 2, 5-9). Le rosette sono pensati per assomigliare a cellule del tubo neurale con un fenotipo anteriore (2, 5, 10) e contengono anche progenitori della cresta neurale (11, 12). Inoltre, essi mantengono un certo grado di plasticità, in quanto possono essere modellata da fattori specifici in condizioni di coltura definiti. Così, il SDIA derivato progenitori neurali possono dare origine a molti tipi di cellule del sistema nervoso centrale e periferico che li rende uno strumento utile per la derivazione di diverse popolazioni di cellule neurali in paradigmi differenziazione delle cellule ES.