ES Cell dérivé des cultures cellulaires neuroépithéliales

Etape 1

1. Plaque mitomycine C ggrowth-inhibée (10 pg / ml pendant 2,5 heures) MS5 cellules à une densité de 70.000 / cm2 sur la gélatine-couché (0,01% pour 30 minutes) 6 assiettes bien dans α-MEM médias.
2. Lorsque les cellules sont attachés et ont formé une monocouche (plus de la croissance de nuit), passer à SRM.
3. Manuellement isoler les colonies de cellules ES à partir des cultures de cellules ES à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 27 G ½.
4. Tritrurate les colonies soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu et plaque à faible densité sur les cellules MS5 (habituellement 2-3 colonies par plaque de 6 puits).

Remarque: Les cellules ES peuvent également être prises à partir de propagation enzymatique utilisant la collagénase ou de trypsine.

Etape 2

1. Cultiver les cellules ES sur la MS5 mangeoires pendant 14-21 jours, jusqu'à rosette contenant former des colonies.

Remarque: Les médias changent souvent. Les rosettes sont généralement à la périphérie des colonies et leur formation peut être grandement améliorée si 300-500 ng / ml Caboche est ajouté à la MRS (3). Dans certains protocoles de différenciation, les MRS peuvent être échangées avec N2-A médias et complétée par la croissance ou d'autres facteurs afin de promouvoir la spécification des cellules (2-5).

Étape 3

1. Isoler et ramasser les rosettes avec une aiguille de calibre 27 ½ sous un microscope.

Remarque: Evitez de couper et ramasser l'MS5 cellules stromales. Si les colonies sont emballés avec des rosettes, on peut également isoler la colonie entière.

Etape 4

1. Aspirer les grappes de rosettes, les tritrurate soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu, et la plaque eux sur la poly-L-ornithine (0,001%) et de la fibronectine (1 pg / ml) ou de la laminine (1 pg / ml) à revêtement 6 puits dans N2-Un média habituellement complétées avec bFGF (20 ng / ml). Les rosettes seront réforme et l'expansion.

Remarque: Pour améliorer la survie des cellules, on peut l'assiette du petites grappes dans les gouttelettes d'augmenter la densité cellulaire. Cette étape peut également être modifié en complétant la N2-Un média avec une croissance supplémentaires ou d'autres facteurs afin de promouvoir la spécification des cellules (2-5).

Ce protocole démontre les différentes étapes de production et d'isoler les cellules neuro-épithéliales des cellules ES humaines à l'aide de SDIA. L'application de cette méthode est multiple et a été utilisé dans de nombreux protocoles à produire des neurones spécifiés (par exemple 1, 2, 5-9). Les rosettes sont pensé pour ressembler à des cellules du tube neural avec un phénotype antérieure (2, 5, 10) et contiennent aussi des progéniteurs de la crête neurale (11, 12). De plus, ils conservent un certain niveau de plasticité, car ils peuvent être modelée par des facteurs spécifiques dans des conditions de culture définie. Ainsi, les progéniteurs neuronaux SDIA dérivés peuvent donner lieu à de nombreux types cellulaires du système nerveux central et périphérique qui en fait un outil utile pour la dérivation des différentes populations de cellules neurales dans les paradigmes de la différenciation des cellules ES.