The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
McLean Hospital, Harvard Medical School
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 184.72.91.94, User IP: 184.72.91.94, User IP Hex: 3091749726
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).
שלב 1
הערה: תאים ES יכולה גם להיות שנלקחו התפשטות אנזימטיות באמצעות collagenase או טריפסין.
שלב 2
הערה: המדיה שינוי לעיתים קרובות. רוזטות הן בדרך כלל בקצוות החיצוניים של המושבות היווצרות שלהם יכול להיות מאוד משופר אם 300-500 ng / ml noggin מתווספת SRM (3). בכמה פרוטוקולים בידול, SRM ניתן להחליף עם N2-מדיה שיושלם עם צמיחה או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).
שלב 3
הערה: הימנע חיתוך לקטוף את MS5 בתאי סטרומה. אם המושבות עמוסים רוזטות, אפשר גם לבודד את המושבה כולה.
שלב 4
הערה: כדי לשפר את הישרדות התא, אפשר הצלחת אשכולות קטנים טיפות להגדיל את צפיפות התאים. צעד זה גם יכול להיות שונה על ידי השלמת N2-מדיה עם צמיחה נוסף או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים ליצירת ובידוד neuroepithelial תאים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות SDIA. יישום של שיטה זו הוא סעפת נעשה שימוש בפרוטוקולים רבים לייצר נוירונים המצוין (למשל 1, 2, 5-9). רוזטות נחשבים דומים התאים בצינור העצבי עם פנוטיפ קדמית (2, 5, 10), מכילים גם אבות הרכס העצבי (11, 12). בנוסף, הם שומרים על רמה מסוימת של גמישות, כיוון שהם יכולים להיות בדוגמת על ידי גורמים מסוימים בתנאים תרבות מוגדרת. לפיכך, SDIA הנגזרות אבות עצביים יכול להצמיח סוגי תאים רבים ממערכת העצבים המרכזית היקפי שהופך אותם כלי שימושי הגזירה של אוכלוסיות תאים שונות עצבית בידול פרדיגמות ES התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM non-essential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01 % solution | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 ml syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6 well plates | for tissue culture |
1. Kawasaki, H. et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 28, 31-40 (2000).
2. Perrier, A.L. et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12543-12548 (2004).
3. Pruszak, J. & Isacson, O. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. (eds.); John Wiley & Sons (2007).
4. Pruszak, J., Sonntag, K.C., Aung, M.H., Sanchez-Pernaute, R. & Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells 25, 2257-2268 (2007).
5. Sonntag, K.C. et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells 25, 411-418 (2007).
6. Kawasaki, H. et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1580-1585 (2002).
7. Ko, J.Y. et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem 103, 1417-1429 (2007).
8. Hong, S., Kang, U.J., Isacson, O. & Kim, K.S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem (2007).
9. Zhang, S.C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol 16, 132-142 (2006).
10. Pankratz, M.T. et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells 25, 1511-1520 (2007).
11. Lazzari, G. et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells 24, 2514-2521 (2006).
12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B. & Goldstein, R.S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells 23, 923-930 (2005).
Sergey Akimov, JHU SOM
1
ReplyPosted by: Sergey A.June 24, 2010, 12:00 PM