רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

MCF-7 זריעת בצלחת-96 היטב:

MCF-7 התאים בתרבית 25 t-בקבוק במדיום המכיל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO _2, 95% האוויר והלחות להשלים. הגיעה לאחר ~ 90% confluency, הם היו מנותקים באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA וספר באמצעות trypan כחול hemocytometer. תאים אלה היו resuspended אז בריכוז של 4 × ⁴ תאים 10 / ² ס"מ והוסיף לצלחת 96-היטב (כלומר, 250 μl / טוב) על ידי פיפטה 8 ערוצים. עבור קליטה רקע, בארות חלקם נשארו בתא חינם, כלומר כביקורת ריק.

טיפול בתאי עם nanopolyplexes שונים:

ב 40-50% confluency (48 שעות זריעת פוסט), התאים מעובדים טופלו nanostructured polyamidoamine dendrimers מהספרים (כלומר, Superfect Polyfect ® ו ®) ו פולימר מבחן הרומן בעקבות הוראה transfection שמספק לו הספק. תאים שטופלו גם עם EGFR ו מקושקשות antisense לבד, עם שלוש nanopolyplexes שונים של שני אלה oligonucleotides ועם פולימרים (n = 4). ארבע בארות היו נשאר לא מטופל כמו שליטה. לאחר 4 שעות בתקשורת טיפול הוסרו מתחדש עם מדיה חדשה.

MTT assay להערכת כדאיות התא:

Assay MTT בוצעה 24 שעות לאחר transfection. למטרה זו, הפתרון MTT הוכן 1mg/ml ב PBS והיה מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. ואז, 50 μl של MTT בתוספת 200 μl של DMEM ללא פנול אדום נוספו לתוך הבאר כל, מלבד התא ללא בארות ריק. התאים הודגרו במשך 4 שעות ב 37 ° C עם 5% CO _2, 95% אוויר ולחות מוחלטת. לאחר 4 שעות, הפתרון MTT הוסרה והוחלפה 200 μl של DMSO ו גליצין 25μl סורנסון של המאגר (גליצין 0.1M, 0.1M NaCl, pH: 10.5 עם 0.1 NaOH). צלחת הודגר עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואת צפיפות אופטית (OD) של בארות נקבע באמצעות קורא צלחת באורך גל של 570 ננומטר הבדיקה ואת אורך גל של 630 ננומטר התייחסות.

Assay MTT נחשבת שיטה צדדי ובהתאם את יכולת הקיום של תאים יכול להיות מוערך על טיפולים שונים. הפקת formazan כתוצאה שנראה יחסית ברמה של מטבוליזם האנרגיה בתאים. לכן, ניתן למדוד את התאים מופעל מטבולית גם בהעדר התפשטות תאים. כמות formazan המיוצר הוא יחסי לכמות MTT במדיום הדגירה. אמנם, את הריכוז של MTT אשר נדרש כדי להשיג את הסכום המקסימלי של formazan מיוצר עשוי להשתנות על ניצול של שורות תאים שונות. חוץ מזה, שיש בשימוש זה assay, מספר קטן מאוד של תאים חיים ניתן היה לזהות את השכיחות של טעויות תהיה מינימלית שכן אין צורך לנקוט צעדים כביסה. קליטת formazan משתנה עם מספר תאים, כמו גם ה-pH אשר ניתן להתגבר עם תוספת של חוצץ ב-pH 10.5 ^1. צבע formazan יציב במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר ^2. במקרה של הצלחת אחד או יותר, שולטת יש לכלול לוחות אחרים. עם זאת, שיטה זו סובלת כמה חסרונות קטנים: א) תאים פעילים מבחינה מטבולית לא יכול להיות מופלים עם התאים המתים ^3, ב) פתרון MTT צריך להיות מוגן מפני אור למרות שזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לכל היותר חודש, ² ג) הוא נכשל כדי לאמת את יציבות התרופה במדיום, ו ד) תאים המשמשים MTT לא ניתן להשתמש בו לאחר מכן עבור כל מבחני אחרות.

זה צריך להיות אדום העלה כי פנול סופג על 570 ננומטר. יתר על כן, זה כבר דיווחו בעבר כי פנול אדום בעל פעילות האסטרוגן, אשר עלול להשפיע על גדילת התאים דפוס בתוך תאים מסוימים מגיבים אסטרוגן, שהתפתח תוצאות MTT מדויק. כדי למנוע השפעה כזו, יש לנו מנוצל DMEM ללא פנול אדום ^4.