Cellulär toxicitet av Nanogenomedicine i MCF-7 Cell Line: MTT assay

MCF-7 sådd i 96-brunnar:

MCF-7 celler odlades i 25 t-kolven i ett medium som innehåller Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml penicillin, och 100 mikrogram / ​​ml streptomycin vid 37 ° C med 5% CO _2, 95% luft och kompletta luftfuktighet. När nått ~ 90% confluency, de var fristående med 0,05% trypsin / EDTA och räknade med hjälp av trypan blått och hemocytometer. Dessa celler har sedan återsuspenderade vid en koncentration på 4 × 10 ⁴ celler / cm ² och läggas in på 96-brunnar (dvs 250 l / brunn) med en 8-kanals pipett. För bakgrund absorption, var några brunnar förblev cellfria, dvs som blankprov.

Att behandla celler med olika nanopolyplexes:

Vid 40-50% confluency (48 timmar efter sådd) var den odlade celler som behandlats med nanostrukturerade dendrimererna starburst polyamidoamine (dvs Superfect ® och Polyfect ®) och en roman testa polymer efter transfektion instruktion från leverantören. Celler behandlades också med EGFR-och äggröra antisens ensam, och med de tre olika nanopolyplexes av dessa två oligonukleotider och med polymerer (n = 4). Fyra brunnar förblev obehandlade kontroll. Efter 4 timmars behandling media togs bort och fylls på med nya medier.

MTT test för att utvärdera cellviabiliteten:

MTT-analysen utfördes 24 timmar efter transfektion. För detta ändamål har MTT lösning som beretts på 1mg/ml i PBS och var filtreras genom ett 0,2 ìm filter. Då var 50 l av MTT plus 200 ìl DMEM utan fenolrött läggas i varje brunn, utom cellfria tom brunnar. Cellerna inkuberades i 4 timmar vid 37 ° C med 5% CO _2, 95% luft och fullständig luftfuktighet. Efter 4 timmar var MTT lösningen bort och ersättas med 200 l av DMSO och 25μl Sörensons glycin buffert (glycin 0,1 miljoner, NaCl 0,1 miljoner, pH: 10,5 med 0,1 NaOH). Plattan ytterligare inkuberas i 5 minuter i rumstemperatur, och den optiska densitet (OD) av brunnarna bestämdes med hjälp av en tallrik läsare på ett test våglängd på 570 nm och en referens våglängd på 630 nm.

MTT-analysen anses vara en mångsidig metod och därmed lönsamheten för de celler kan utvärderas på olika behandlingar. Produktionen av resulterande formazanförening verkar stå i proportion till graden av energiomsättningen i cellerna. Därför är det möjligt att mäta metaboliskt aktiverade celler även i frånvaro av cellproliferation. Mängden formazanföreningen produceras är proportionell mot mängden MTT i inkubationstiden mediet. Medan producerade koncentrationen av MTT som krävs för att uppnå maximalt formazanförening kan förändras vid användning av olika cellinjer. Dessutom att ha använt denna analys, kan mycket litet antal levande celler kan upptäckas och förekomsten av fel skulle vara minimal eftersom det inte finns något behov av tvätt steg. Absorptionen av formazanförening varierar med mobilnummer samt pH som kan övervinnas med tillsats av buffert vid pH 10,5 ^1. Färgen på formazanföreningen är stabil under några timmar i rumstemperatur ^2. Vid mer än en tallrik, bör kontroller ingå i andra plattor också. Ändå lider den här metoden från några mindre nackdelar: a) metaboliskt inaktiva celler kan inte diskrimineras med döda celler ^3, b) MTT-lösning ska skyddas från ljus, även om det kan lagras vid 4 ° C i högst en månad ² c) den inte validera drog stabilitet på medellång och d) celler som används för MTT inte senare kan användas för något annat analyser.

Det bör framkallas som fenolrött absorberar vid 570 nm. Vidare har det tidigare rapporterats att fenolrött besitter östrogen aktivitet som kan påverka mönstret celltillväxt inom några östrogen lyhörd celler, och som grundar oprecisa MTT resultat. För att undvika sådana effekter har vi utnyttjat DMEM utan fenolrött ^4.