Toxicité cellulaire des Nanogenomedicine dans la lignée cellulaire MCF-7: test MTT

MCF-7 semis en plaque de 96 puits:

Cellules MCF-7 ont été cultivées dans 25 t-ballon dans un milieu contenant Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO _2, 95% air et l'humidité complète. Une fois atteint ~ 90% de confluence, ils ont été détachés en utilisant 0,05% de trypsine / EDTA et comptées par les moyens de bleu trypan et hémocytomètre. Ces cellules ont ensuite été remises en suspension à une concentration de 4 x 10 ⁴ cellules / cm ² et ajouté sur plaque de 96 puits (ie, 250 ul / puits) par une pipette à 8 canaux. Pour l'absorption de fond, certains puits ont été resté sans cellule, c'est à dire que le contrôle vierge.

Traitement des cellules avec nanopolyplexes différentes:

À 40-50% de confluence (48 heures après l'ensemencement), les cellules cultivées ont été traités avec nanostructurés dendrimères polyamidoamine Starburst (ie, Superfect ® et Polyfect ®) et un polymère nouveau test en suivant les instructions fournies par le fournisseur de transfection. Les cellules ont été également traités avec EGFR et brouillés antisens seul, et avec les trois nanopolyplexes différente de ces deux oligonucléotides et par des polymères (n = 4). Quatre puits ont été n'ont pas été traités comme contrôle. Après 4 heures du traitement médiatique ont été enlevés et reconstituées avec des milieux frais.

MTT pour l'évaluation de la viabilité cellulaire:

MTT a été réalisée 24 heures après transfection. Pour ce faire, la solution de MTT a été préparé à 1mg/ml dans du PBS et a été filtré à travers un filtre de 0,2 um. Ensuite, 50 ul de MTT et 200 ul de DMEM sans rouge de phénol ont été ajoutés dans chaque puits, à l'exception des puits sans cellules vides. Les cellules ont été incubées pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2, 95% d'air et d'humidité complète. Après 4 heures, la solution de MTT a été enlevé et remplacé par 200 ul de DMSO et 25 pi de Sorenson tampon glycine (glycine 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 à 0,1 NaOH). La plaque a été incubée pendant encore 5 min à température ambiante, et la densité optique (DO) des puits a été déterminée en utilisant un lecteur de plaque à une longueur d'onde de test de 570 nm et une longueur d'onde de référence de 630 nm.

Le test MTT est réputé être une méthode souple et donc la viabilité des cellules peut être évaluée sur divers traitements. La production de formazan résultante semble être proportionnelle au niveau du métabolisme énergétique des cellules. Par conséquent, il est possible de mesurer les cellules métaboliquement actives même en l'absence de prolifération cellulaire. La quantité de formazan produite est proportionnelle à la quantité de MTT dans le milieu d'incubation. Alors, la concentration de MTT qui est nécessaire pour atteindre le montant maximum de formazan produit peuvent varier en fonction de l'utilisation de différentes lignées cellulaires. En outre, après avoir utilisé ce test, très petit nombre de cellules vivantes pouvaient être détectées et l'incidence des erreurs seraient minimes, car il n'est pas nécessaire pour les étapes de lavage. L'absorption de formazan varie avec le nombre de cellules ainsi que du pH qui pourrait être surmonté avec l'addition de tampon à pH 10,5 ^1. La couleur de formazan est stable pendant quelques heures à température ambiante ^2. Dans le cas de plus d'une plaque, les contrôles devraient être inclus dans les autres plaques ainsi. Néanmoins, cette méthode souffre de quelques inconvénients mineurs: a) cellules métaboliquement inactifs ne peuvent pas être discriminés en cellules mortes ^3, b) solution de MTT doit être protégé de la lumière, même si elle pouvait être conservés à 4 ° C pour un maximum d'un mois ^2, c) il ne parvient pas à valider la stabilité du médicament dans le milieu, et d) les cellules utilisées pour MTT ne peut ensuite être utilisé pour tout autres tests.

Il doit être évoqué que le rouge de phénol absorbe à 570 nm. En outre, il a été indiqué précédemment que le rouge de phénol possède une activité oestrogène qui peuvent affecter le modèle de croissance cellulaire dans certaines cellules répondant aux œstrogènes, qui a suivi les résultats MTT imprécis. Pour éviter un tel effet, nous avons utilisé DMEM sans rouge de phénol ^4.