The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Department of Biology, University of Waterloo
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.19.155.235, User IP: 50.19.155.235, User IP Hex: 840145899
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Reed, B. H., McMillan, S. C., Chaudhary, R. The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol. J. Vis. Exp. (25), e1206, doi:10.3791/1206 (2009).
إعداد
إجراء
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
نحن تصف طريقة جديدة لإعداد أجنة ذبابة الفاكهة لتحليل التصوير الحي ، الذي نسميه بروتوكول قطرة شنقا. لسوء الحظ ، فإنه ليس من الممكن استخدام بروتوكول إسقاط عقوبة الاعدام شنقا اذا عمل مع مجهر مقلوب. ويجب في هذه الحالة يمكن استخدام هذه التقنية يقحم (كما هو موضح في أعلاه مجردة) ، وضغط من الأجنة لا تزال مصدرا للقلق.
في التجارب حيث يتم قياس حجم وشكل خلية لحساب القوات التابعة لحركة التخلق ، واستخدام المجهر تستقيم وبروتوكول قطرة شنقا هو الأفضل نظرا لضغط الجنين مخفضة. أيضا ، وانخفاض ضغط الجنين باستخدام بروتوكول قطرة شنقا لديه نتيجة لتعرض السطح الدائري ، غير مشوهة للجنين في حين أن تقنية يقحم يعرض سطح بالارض. عند استخدام الفحص المجهري متحد البؤر هو ، بالتالي ، من الضروري جمع. أوسع Z - المكدس (أكثر الشرائح في كومة) عند استخدام بروتوكول قطرة شنقا في مقابل الأسلوب يقحم زيادة عدد الشرائح في Z - مكدس ، ومع ذلك ، ويزيد من اكتساب الوقت ، وكذلك أي السمية الصورة أو تبييض الصورة المرتبطة مع الإثارة الليزر. بوضوح ، ويعوض بعض الشيء لصالح التجريبية المرتبطة ضغط بنسبة زيادة في أوقات اكتساب Z - المكدس. على الرغم من هذه الزيادة في الوقت اقتناء Z - المكدس ، ومع ذلك ، فقد لاحظنا استمرارية ممتازة للأجنة باستخدام بروتوكول قطرة شنقا.
غير محدودة أيضا بروتوكول قطرة شنقا لمراقبة الأجنة المجهري مضان ، حيث المسار ضوء الحادث والضوء المنبعث لا تمر عبر غرفة حية التصوير. ويمكن تحقيق العيش التصوير المجهري باستخدام أجنة مدينة دبي للإنترنت أو غيرها من البصريات غير مضان بتعديل غرفة حية التصوير للسماح للمسار الضوء من خلال المكثف للجنين مع وقف التنفيذ.
ويجوز للقلق عند استخدام تقنية هبوط شنقا تكون حركة غير مرغوب فيها أو "الانجراف" للأجنة في مجال الرؤية خلال اقتناء timelapse. عندما يتحرك ضد السفلي من ساترة المقلوب ، نجد أن الأجنة بشكل ملحوظ وثابت لا تغيير في الموقف عند استخدام إما جافة أو أهداف غمر النفط. timelapse اقتناء متعددة باستخدام المجهر بمحركات المرحلة أيضا لن يؤثر سلبا على مواقف الأجنة التي يتم إعدادها باستخدام بروتوكول قطرة شنقا. يمكن القضاء على أي حركة للأجنة باستخدام تقنية أعدتها قطرة شنقا عن طريق تخفيض حجم الهالوكربون انخفاض اسعار النفط ، وضمان أن قطرات النفط ليست منفصلة أو فتل الصمامات على طول حافة يعيش في غرفة التصوير أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
نحن نعترف بامتنان الدعم لBHR من خلال منحة ديسكفري فضلا عن أدوات البحث والمنح الصك من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC). نعترف أيضا H. أودا وذبابة الفاكهة بلومينغتون المخزون مركز لتوفير مخزونات الجينية التي تم استخدامها في تسلسل سبيل المثال التصوير الحي.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 l. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
