The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Biology, University of Waterloo
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Reed, B. H., McMillan, S. C., Chaudhary, R. The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol. J. Vis. Exp. (25), e1206, doi:10.3791/1206 (2009).
तैयार
प्रक्रिया
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हम रहते इमेजिंग विश्लेषण है, जो हम फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल फोन के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण तैयारी की एक नई विधि का वर्णन. दुर्भाग्य से, यह संभव करने के लिए फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग अगर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ काम नहीं है. Sandwiching तकनीक (के रूप में वर्णित सार ऊपर) और इस मामले में इस्तेमाल किया जाना चाहिए भ्रूण के संपीड़न एक चिंता का विषय बनी हुई है.
प्रयोगों में जहां सेल आकृति और आकार के क्रम में morphogenetic आंदोलन के साथ जुड़े बलों की गणना मापा जाता है, एक ईमानदार खुर्दबीन और फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग कम भ्रूण संपीड़न के लिए बेहतर कारण है. इसके अलावा, कम भ्रूण फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग संपीड़न दौर, भ्रूण के undistorted सतह पेश sandwiching तकनीक जबकि एक चपटी सतह प्रस्तुत करने का परिणाम है. जब confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर यह है, इसलिए करने के लिए आवश्यक इकट्ठा एक व्यापक (ढेर प्रति अधिक स्लाइस) जेड ढेर जब sandwiching विधि बनाम फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग. Z ढेर प्रति स्लाइस की संख्या में वृद्धि, हालांकि, किसी भी तस्वीर विषाक्तता या तस्वीर विरंजन लेजर उत्तेजना के साथ जुड़े के रूप में अधिग्रहण के समय के रूप में अच्छी तरह से बढ़ जाती है. जाहिर है, प्रयोगात्मक कम संपीड़न के साथ जुड़े लाभ कुछ जेड ढेर अधिग्रहण बार में वृद्धि द्वारा ऑफसेट है. Z-ढेर अधिग्रहण के समय में इस वृद्धि के बावजूद, तथापि, हम फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग भ्रूण के उत्कृष्ट व्यवहार्यता मनाया.
फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा भ्रूण के अवलोकन घटना और उत्सर्जित प्रकाश का प्रकाश पथ में जो रहते इमेजिंग कक्ष के माध्यम से पारित नहीं है तक सीमित है. लाइव इमेजिंग भ्रूण डीआईसी माइक्रोस्कोपी या अन्य गैर प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी का उपयोग रहते - इमेजिंग कक्ष को संशोधित करने के लिए निलंबित भ्रूण के माध्यम से संघनित्र से एक प्रकाश पथ की अनुमति के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
एक चिंता का विषय है जब फांसी ड्रॉप तकनीक का उपयोग अवांछनीय आंदोलन या timelapse अधिग्रहण के दौरान देखने के क्षेत्र में भ्रूण की "बहती" हो सकता है. जब उल्टे coverslip के underside के खिलाफ चल, हम पाते हैं कि भ्रूण उल्लेखनीय स्थिर और बदलाव जब या तो सूखा या तेल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग कर की स्थिति में नहीं है. बहु timelapse एक motorized खुर्दबीन मंच का उपयोग अधिग्रहण भी भ्रूण की स्थिति है कि फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए तैयार हैं बाधित नहीं करता. फांसी ड्रॉप तकनीक के प्रयोग से तैयार भ्रूण के किसी भी आंदोलन हेलोकार्बन तेल बूंद के आकार को कम करने और सुनिश्चित करना है कि अलग तेल बूँदें fusing या रहते इमेजिंग कक्ष में अच्छी तरह से है की बढ़त के साथ wicking नहीं हैं के द्वारा समाप्त किया जा सकता है है.
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हम कृतज्ञता एक डिस्कवरी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुदान एक अनुसंधान उपकरण और साधन अनुदान से प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) के माध्यम से BHR समर्थन स्वीकार करते हैं. हम भी एच. ओडीए और ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र आनुवंशिक स्टॉक है कि उदाहरण के रहते इमेजिंग दृश्यों में इस्तेमाल किया गया प्रदान करने के लिए स्वीकार करते हैं.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard equipment and materials required to prepare embryos for live-imaging using the hanging drop protocol include the following items: microscope slides | |||
| coverslips (22 x 40 mm, No. 2) | |||
| double-sided tape | |||
| jeweller’s forceps (Dumont style No. 5) | |||
| halocarbon oil series 56 and series 700 (Halocarbon Products Corp.) | |||
| a utility knife or single edge razor blade | |||
| tissue paper | |||
| scissors | |||
| distilled water | |||
| general purpose tape | |||
| a pipet suitable for delivering 20-40 l. | |||
| The live imaging protocol also requires a custom-made live imaging chamber. This is prepared by cutting a 5 mm think polycarbonate plastic sheet to the dimensions of a standard microscope slide (75 X 25 mm) and using a rotor to create a 3mm deep depression in the slide (20 X 55 mm). Access to a stereomicroscope (dissecting microscope) and a fiber-optic illumination source is also required. | |||
