IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광… (Translated to Korean)

Cite this Article: IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum. J. Vis. Exp. (26), e1210, doi:10.3791/1210 (2009).

Abstract: IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

4T1 마우스 내유 종양 세포는 15~20일에 만져서 알 수있는 종양을 형성 뉴 / 뉴 생쥐의 하위 cutaneously 이식 수 있습니다. 이 이종 이식 종양 모델 시스템 putative antitumor 화합물의 생체내 평가 미리 임상을 위해 중요합니다.

4T1 세포 라인은 constitutively 반딧불 루시페라제 유전자 (luc2)을 표현하기 위해 설계되었습니다. 4T1 - luc2 종양을 나르는 생쥐는 종양 IVIS 스펙트럼 같은 민감한 광학 이미징 시스템을 사용하여 모니터링할 수있는 영상 조명 신호를 방출 Luciferin로 주입하는 경우. 종양에서 광자 플럭스은 발광 세포의 개수에 비례하여 신호가 종양 성장과 발전을 모니터 측정할 수 있습니다. IVIS는 발광 생물 신호 및 종단 연구의 절대 quantitation이 양적 결과를 손상시키지 않고 몇 개월 동안 신호 크기의 여러 명령을 통해 수행할 수 있도록 조정합니다.

종양 크기가 기존의 물리적인 방법으로 만져서 알 수있는 또는 측정되기 전에 종양 성장 bioluminescence으로 며칠 동안 모니터링할 수 있습니다. 이것은 급속한 모니터링 종양 발달 초기에 이벤트에 대한 통찰력을 제공하거나 짧은 실험 절차를 초래할 수 있습니다.

종양 세포 죽음과 hypoxia 또는 약물 치료에 의한 괴사는 발광 생물 신호의 감소에 의해 초기 표시됩니다. 이 세포 죽음을 물리적인 방법으로 측정으로 종양의 크기 감소에 의해 동반되지 않을 수도 있습니다. 종양 괴사의 초기 이벤트를 볼 수있는 능력은 치료 요원의 선택과 개발에 상당한 영향을 미치고 있습니다.

IVIS를 사용하여 종양 성장의 양적 영상은 정확한 quantitation를 제공하고 결과를 생성하기 위해 실험 과정을 가속.

Protocol: IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

루시페라제 표현 암 세포 라인의 다양한는 마우스 모델에서 미리 임상 연구에 사용될 수 있습니다.

이러한 세포는 쉽게 선택 마커에 대한 필요가 표준 미디어 성장하는 병원체가없는 냉동 문화로 제공됩니다.

우리의 실험을 위해, 우리는 생체내의 유전자 발현이나 tumorgenesis의 광학 지표 역할을 루시페라제 유전자를 표현 4T1 - luc2 murine 내유 종양 세포 라인을 사용합니다. 우리는 비 invasively 기본 종양의 성장을 추적하는 루시페라제 표현을 사용하지만, 그들은 또한 전이성 병변을 찾아 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

루시페라제 활동 주입하기 전에, 그리고이 작업을 수행하기 위해서는 검증해야 90% 합류 플라스크는 trypsinization에 의해 수확 후 계산됩니다.

수행하는 50,000 셀이 다음 microtiter 접시 및 시리얼 dilutions의 단일 우물에 적절하고 있습니다. Luciferin는 ML 당 150ug에있는 우물에 추가 2 분 동안 incubated입니다. microplate는 IVIS이나 표현 수준을 결정하는 발광 판 Reader에서 몇 군데 있습니다. 이 세포 라인은 초당 세포 당 6,500 광자까지 표현하고 있지만, 초당 셀 당 500 광자 이상 어떤 표현 수준은 생체내에서 성공적으로 몇 군데 있습니다.

이제 우리는 최적의 활동의 세포를 가지고, 우리는 피하 주입 단계로 진행할 수 있습니다.

종양의 최적의 검출을 용이하게하기 위해, 우리는 athymic immunocompromised 누드 마우스 변형을 사용하고 있습니다. 주사하기 전에, 동물 깊은 마취에 대한 효과 anesthetized 있습니다.

다음 우리가 100ul PBS에서 250,000 세포까지 주사할 수는 측면으로 subcutaneously 주입하고 있습니다. 1 ML의 주사기에있는 세포를로드하고 26 게이지 바늘을 첨부합니다. 포셉는 "텐트"하고 기지에 세포를 주입 함께 부드럽게 피부를 들어 봐요. 새로 주입된 세포는 즉시 몇 군데 있습니다. 각 이미지 세션에서 kg의 체중 당 Luciferin의 150mg의 총 후 복막 구멍 두개의 주사를 통해 관리합니다.

본 연구에서는 동물은 일관성있는 광자 유량을 보장하기 위해 Luciferin 주입 후 10 분 몇 군데 있습니다. 우리는 다음 단계에서 당신에게 보여 드리죠. Luciferin 동력학은 매일 다를 수 있습니다. 이 특정 모델에서 Luciferin 주입 후 10 분 측정하면 15 %의 다양성의 범위 내에서 결과를 주었다.

우리 실험에서는 우리는 다시 - thinned 요금 결합 소자 ° C 최대 감도를 달성하기 위해 -90으로 냉각을 사용하여 생체내 이미징 시스템에서 IVIS 스펙트럼을 사용합니다. 절대 quantitation를 지원하기 위해, 시스템 다운 시간 동안 어두운 요금을 측정하고 초기화하는 동안 자체 보정을 실행합니다. 이미징을 시작하려면, IVIS 시스템을 초기화 (한 번의 클릭) 및 실험을위한 이미징 매개 변수를 설정합니다.

몇 군데되는 동물의 숫자에 대한보기의 필드를 선택합니다. 최대 5 동물은 필수 마취 매니폴드를 사용하여 장비 유지하실 수 있습니다. 무대는 상수입니다 37 ° C 동물의 체온을 유지하기 위해. EKG 포트가 스트레스 절차 기간 동안 동물의 건강을 모니터링하기 위해 제공됩니다.

이미지 소프트웨어, 노출 시간, F - 중지하고 픽셀을 생활 비닝은 세포주의 표현 수준에 따라 최적화할 수 있습니다. 이러한 설정은 양적 결과에 영향을주지 않고 실험 도중 언제든지 변경할 수 있습니다.

IVIS 흰 빛과 이미지를 중첩되는 정량 발광 생물이나 형광 신호, 아래에있는 동물의 사진 이미지를 얻습니다.

발광 생물 신호는 초당 광자로 표현하고 강도지도로 표시됩니다. 이미지 디스플레이는 quantitation에 영향을주지 않고 이미지에 최적의 콘트라스트와 해상도를 제공하기 위해 조정됩니다.

세포에서 발광이 관심을 도구의 영역을 사용하여 주사의 사이트에서 측정할 수 있습니다. 측정 데이터는 저장하거나 분석을 위해 내보낼 수있는 이미지 캡처에 관한 모든 실험 매개 변수와 함께 테이블에 표시됩니다

여러 이미지를 획득하여 실험의 특성에 따라 초 개월에 걸쳐 종단 연구에 비교할 수 있습니다. 우리는 시간 제로에서 종양에서 광자 자속을 측정하고 격주 간격으로 이미지와 함께 4 주 동안 모니터합니다.

종양에서 광자 유량은 bioluminescence는 종양의 크기와 직접 연결합니다 그래서 루시페라제을 표현하는 라이브 세포의 수에 비례합니다.

오일 포스트 주입에 종양이 아직 만져서 알 수있는 것이 아니라 세포가 bioluminescence과 종양이 적극적으로 성장을 보아입니다 통해 계량하실 수 있습니다. 이 단계에서는 bioluminescence 신호는 훨씬 stronge입니다R. 노출 시간, F - 중지하고 픽셀 비닝는 이미지가 명확하고 카메라가 포화되지 않도록 조정할 수 있습니다. 이러한 측정은 실험에 이전 이후 수집들에게 비교할 수 있도록 IVIS 자동으로 집광의 변화에 대한 보상.

칠일에 게시 주입 종양 측정은 이미 데이터가 7 일 발생한 것은 이번이 처음과 bioluminescence에 대한 만져서 알 수있는 수 있습니다.

28일 포스트 주입에서 종양 괴사되고 있으며, 세포는 죽지 시작합니다. 캘리퍼스 측정하여 예상 종양 크기는 appreciably 변경되지 않습니다하지만, 종양의 발광은 세포 죽음을 나타내는 줄어 듭니다.

인도적 종점에 도달할 때까지 캘리퍼스 측정 및 bioluminescence 측정 계속하실 수 있습니다. hypoxia 또는 치료 정권에 의한 종양 괴사들은 종양 질량을 감소하지 않더라도 감소 bioluminescence로 표시됩니다.

Disclosures: IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

나는 시각 실험이 문서의 저널을 생산하기 위해 수행 모든 실험이 기관 애니멀 케어 승인한 동물 프로토콜 060을 준수 수행 있다고 확신하고 칼리퍼 생명 과학에서위원회 (IACUC), 알라 메다 CA 재 김 박사를 사용하고 싶습니다 . D., IACUC 위원장, 칼리퍼 생명 과학.

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18 Comments

I can't see any vedio, why?

Posted by: Jack M.April 30, 2009, 8:57 AM

Jack, sorry you are having problems. Please check that you have Flash installed. If you still have problems, please send me an email at nikitab@jove.com and I'll help you out.

1.1

Posted by: AnonymousApril 30, 2009, 10:37 AM

1.why did you give 2 injections of the ip luciferin?
2.Do you have correlation in the caliper measurements compared to the BLI measurements?

Posted by: Tomi O.June 22, 2009, 7:18 AM

Hi Tomi,

1) Two ip injections of luciferin are given in case of a missed injection, although a partial dose may not give you a satisfactory image (in which case you will need to re-image the animal). A single injection of luciferin can be administered and the animal may be conscious or unconscious. Select a method and use it consistently throughout your study to avoid any variability.

2) Yes, there is correlation between bioluminescence and caliper measurements in the 4T1-luc2 subcutaneous model.

2.1

Posted by: Ed L.June 26, 2009, 5:29 PM

Microparticles can be stained fluorescently or a labeled compound in a microparticle can be traced in vivo as long as either is sufficiently bright and the signal doesn’t interfere with that from the labeled cells. I don’t know what type of microparticle you are using but there are commercially available staining kits depending on the type.
Yes, you can inject non-labeled cells subcutaneously and visualize the resulting tumor with a fluorescently-labeled antibody.

3.1

Posted by: Ed L.January 8, 2010, 7:46 PM

Is it possible to trace microparticles loaded with a drug in vivo ? If positive how should I label them? Also would it be possible to visualize in the way you showed in video antibodies directed to non-labeled tumoral cells?

Thanks

G

Posted by: AnonymousAugust 19, 2009, 2:18 PM

How can I use this methods to quantify apoptosis?

Posted by: Silvio M.December 9, 2009, 1:05 AM

Miranda,

Here is a nice publication covering apoptosis:
Clinical Cancer Research 2008;14(8) April 15, 2008

6.1

Posted by: Ed L.January 8, 2010, 7:48 PM

How can I use this methods to quantify apoptosis?

Posted by: Silvio M.December 9, 2009, 1:06 AM

New in this. I have a question:
The signal intensity change over time, in order to give a good pic. I guess people use different settings at different time point. The picture thus are not comparable? How could I take the pictures over time under different settings but still comparable?

Thanks a lot.

L

Posted by: LDecember 28, 2009, 12:35 PM

As the tumor increases in size, the light emission will increase and camera settings may need to be adjusted so as not to get a saturated image (which cannot be accurately quantified). When performing a longitudinal study, it would be ideal to have all the images with the same scale and binning. You may not always be able to use the same scale for the entire study but you can still get a good overall picture of disease progression. If you select the same units throughout (ie “photons/second/cm2/sr”), the images and quantification will be comparable. In the case where different binning was used to capture the image, the Living Image software allows you to change the binning on any image after it was taken.

8.1

Posted by: Ed L.January 8, 2010, 7:50 PM

Is there a reason to nu/nu mice vs. normal Balb/C mice ? 4T1 is a syngeneic xenograft model.

Posted by: AnonymousJanuary 27, 2010, 2:00 PM

Is there a reason to use nu/nu mice vs. normal Balb/C mice ? 4T1 is a syngeneic xenograft model.

Posted by: AnonymousJanuary 27, 2010, 2:00 PM

Nu/nu mice would be preferable if you are using fluorescence. Fur will auto-fluoresce and may mask your signal (you can shave or use a depilatory in this case). Otherwise, we could have also used a Balb/C mouse with the 4T1-luc2 in the video.

10.1

Posted by: AnonymousJanuary 27, 2010, 4:07 PM

hello Is there any mice model for the research of glioma? Our lab has just begin the study in this area.We really need some help here.

Posted by: AaronApril 20, 2010, 9:09 AM

Hi Aaron,

There is a very good video demonstrating this procedure www.jove.com/index/Details.stp?ID=1986
You can use U87-MG-luc cells.

11.1

Posted by: AnonymousSeptember 21, 2010, 3:14 PM

In the video you've mentioned monitoring of metastatic lesions.
What settings do I need to enter in order to see the lesions (in my case lymph node mets) with the primary tumor in one hole body shot?

Posted by: rachelSeptember 20, 2010, 6:33 AM

Hi Rachel,

The primary tumor will be very bright while the lymph node metastases will be dim. You won't be able to image everything in a single, whole body image. In order to image the mets, you will need to shield the primary tumor and try imaging with large binning for 3 minutes as a start. Adjust your exposure time as needed and you can also change the FOV to bring the animal closer to the camera.

12.1

Posted by: EdSeptember 21, 2010, 1:01 PM

Is is possible to use this method for imaging intra-abdominal metastases? Are there any specific tricks to doing so (other than placing the mouse on its back) and imaging for very dim signals?

Posted by: Mary HoltzJune 7, 2011, 5:13 PM

Dr. Holtz,
Using the exact same method, you can image intra-abdominal metastases. You may want to use brighter cells to increase your chances to detect small metastases.

Posted by: Jae KimJune 7, 2011, 6:08 PM

Dear Mr. Lim,

I'm new to the IVIS technology and I have some problems understanding the absolute quantitation of the obtained data. Prior to s/c injection of Luc2-cancer cells, cel expression levels were measured via dilution series in 96 well plate. I understand that after using the averaging tool one receives a certain value expressed in photons/sec/cell (for instance 700 p/s/cell). After injection of these cells, several bioluminescent pictures were taken in function of time. When ROI analyses is performed and data is displayed in Radiance mode, one obtaines a value in photons/sec/cm²/sr (for instance 7x10E7 p/s/cm²/sr) . How does one now quantify the amount of cells ? In the example between brackets, would this be a cell number of 100000 cells in a tissue surface area of 1cm² ?

Kind regards

Posted by: BramSeptember 20, 2011, 4:08 PM

Hi Bram,

The well plate values cannot be used directly to quantitate the in vivo image. Imaging the cells on the well plate gives you the light output in photons/sec and you can further calculate the photons/sec/cell to ensure that the cells are within the parameters in the product sheet. For in vivo imaging, a specified number of cells are injected into the animal and imaged. The light output is in units of photons/sec/cm^2/sr. This is the light that is detected at the surface of the animal per square centimeter per steradian. The bioluminescent signal will increase as the tumor increases in volume. Quantitating the in vivo signal needs to be approached with caution: photon intensity decreases with increase in tissue depth and optical properties of tissues may affect scattering/absorption of light (i.e. necrosis).

Ed

15.1

Posted by: Ed LimOctober 12, 2011, 7:39 PM

what is the type of 96 -microwell plate do you use?what is the lotnumber of it ?

Posted by: lilyOctober 8, 2011, 10:31 PM

Hi Lily,

We use 96-well plates with black walls and clear bottom (polystyrene). The particular plate is Costar #3603.

Ed

16.1

Posted by: Ed LimOctober 12, 2011, 7:42 PM

Hi,
I have been trying the same procedure for LUC B16F10 cells..but I am not getting any signal in vitro... I tried changing the procedure for luminescence but not getting any results. i have tries seeding different number of cells in 12 well plate, though cannot see any signal. What could be the possible reason for the same? and can i just use PBS+luciferin for the imaging instead of the complete media?

thanks,
Krishna

Posted by: krishnaFebruary 20, 2012, 12:04 PM

Hi Krishna,

Are your B16F10 cells luc or luc2? The luc version has a light output of 15photons/second/cell whereas the luc2 version is brighter at 450ph/sec/cell. In contrast, 4T1-luc2 is about 6500ph/sec/cell. What is your exposure time when you image your cells? You may need to use a longer exposure time and a larger binning to see a signal. Hope this helps.

Ed

Posted by: Ed LimMarch 6, 2012, 3:14 PM

Hi,

our group is working on adoptive T cell therapy and is successfully using the IVIS 200 for tracing T cells and measuring tumor size.
But since I'm new I do have some questions no one could properly answer :-)

We always inject the substrate (Luciferin od Coelenterazine) i.v.
Is there a difference to s.c. or i.p. injection?

And I was wondering if one could also detect resting tumor cells in the bone marrow? Or is the luc2 signal (of let say 1-6 cells) to weak to shine thru the bones?

Thanks,

Peter

Posted by: Peter M.June 15, 2012, 7:23 AM

hi, i am in confusion and would like to know from you that,
is bioluminescence signal in photos/sec/cm2 just shown of tumors ? why it is not shown of other live cells of mouse other than tumor? is luciferin is selective to tumors or what would be the reasons?pls

Posted by: arjun t.November 7, 2012, 7:13 PM

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Date Published	4/29/2009
JoVE Section	General
JoVE Issue	26
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DOI	doi:10.3791/1210

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IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

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