Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

1. Preparación de los ARNm para inyección

1. El ARNm utilizados en este procedimiento se transcribe a partir de un plásmido que codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. En primer lugar linealizar el plásmido de acuerdo con Gutzman et al, 2008.
2. A continuación transcribimos ARNm memGFP con el mMessage mMachine kit.
3. Diluir el ARNm resultante de 1μg/μl, alícuota y almacenar a -80 ° C.
4. Preparar un molde de inyección de agarosa al 1% con los carriles de la anchura de los embriones en la etapa de la célula.
5. El día antes de la inyección, creado jaulas de apareamiento que separa el macho de las hembras.
6. En el día de la inyección, tire agujas capilar mediante un extractor de micropipeta para preparar la inyección.

2. La inyección del ARNm

1. En el día de la inyección, descongelar una alícuota de ARNm memGFP 1μg/μl en el hielo.
2. Diluir el ARNm de 1:5 en agua a una concentración final de 200ng/μl, y mantener en hielo.
3. La carga de la aguja capilar con 1μl de ARNm memGFP preparados en 200ng/μl.
4. Lugar cargado de aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector gas.
5. Ajustar el volumen de inyección de 1NL.
6. Tire de los separadores de la pesca de tipo salvaje establecido en las jaulas de apareamiento del día anterior.
7. Recoger los embriones tan pronto como se ponen. Orientarlos en el molde de inyección de agarosa cubierta por medio de embriones (Westerfield, 1995) con la única célula en el lado opuesto de la micromanipulador.
8. Inyectar a través del corion y la yema de tal manera que el ARNm es depositado directamente en la célula. Inyectar aproximadamente 50 embriones por experimento. No se inyecte, si la célula se ha dividido.
9. Embriones se incuban a 28 ° C durante la noche en medio de embriones

3. Montaje de imágenes y embriones

1. Para montar la imagen y los embriones, retire el corion con las pinzas de los embriones en un estereomicroscopio una hora antes del punto en el tiempo de interés.
2. Prepare una diapositiva para montar hasta cuatro embriones.
   • Utilice grasa de silicona para sellar al vacío un cubreobjetos en la parte inferior de una diapositiva de plástico especialmente diseñada 2mm de espesor con un agujero de aproximadamente 1 cm de diámetro.
   • Llenar el agujero en la diapositiva con el 0,7% de agarosa, y se deja reposar unos 20 minutos o hasta que se endurece
   • Una vez que la agarosa se ha solidificado, retirar un pequeño tapón con 200μl puntas de las pipetas para formar un agujero cilíndrico en el que se montará cada embrión.
3. Colocar los embriones en la diapositiva llena de agarosa con un microscopio de disección. Añadir 50μl de tricaína (Westerfield, 1995) para anestesiar a los embriones.
4. El uso de fórceps para colocar los embriones en los agujeros cilíndricos en la agarosa con el cerebro o la región de interés sobre el cubreobjetos subyacente.
5. Cubrir los embriones en la agarosa con otro portaobjetos asegurado con grasa de vacío de silicona.
6. Imagen del embrión utilizando un invertido, fluorescentes, de escaneo láser o girando microscopio confocal de disco. Imagen de 63x o superior para obtener imágenes de alta resolución de las células individuales dentro de la neuroepithelium.
7. Las imágenes se exportan como archivos TIFF del software LSM y se analizaron usando Photoshop.

4. Resultados representante / Resultados

Muestra en la Figura 1 es una imagen representativa confocal de un pez cebra neuroepitelio 24 HPF entre el cerebro medio y los ventrículos del cerebro posterior. Cada célula está marcada con GFP unido a la membrana.

Figura 1. Imagen confocal en vivo de una inyección de 24 memGFP embrión de pez cebra HPF.
(A) neuroepitelio de un embrión de 24 HPF con cada celda se indica por las buenas prácticas agrarias. Zona visualizada separa los ventrículos del cerebro medio y cerebro posterior (M, H, respectivamente), que forma el límite posterior del cerebro cerebro medio.

En este vídeo, se demuestra un método para la inyección de ARNm en una sola célula de embriones de pez cebra. En este sentido, el uso de ARNm que codifica una membrana GFP dirigida a la etiqueta de cada célula. A continuación se muestra cómo montar y la imagen del cerebro en desarrollo con una resolución única célula. Esta técnica nos ha permitido estudiar un nuevo tipo de cambio en las células forma, constricción basal, necesario para la formación de la frontera del cerebro medio-hindbrain (Gutzman et al, 2008). Un análisis similar de otros fenómenos tiene el potencial para expandir significativamente nuestra comprensión de la morfogénesis de los vertebrados y la biología celular subyacente.