Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

,

Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.242.188.217, User IP: 54.242.188.217, User IP Hex: 921877721

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (25), e1229, doi:10.3791/1229 (2009).

Abstract: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

שלמה הר

Protocol: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

1. קיבעון

  1. תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS.
  2. הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
  3. עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים שען. לאחר dechorionation, העוברים מועברים באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן.
  4. העברת עוברים דרך סדרה של 25%, 50% מתנול 75% PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  5. החלפת נוזל עם 100% מתנול, דגירה 5 דקות ולאחר מכן להחליף עם מתנול טריים.
  6. מקום בו עוברים -20 ° C למשך תקופה מינימלית של שעה אחת. (אנחנו בדרך כלל לדגור העוברים בין לילה. רגיל ב הכלאה באתרו יעבוד על עוברי מאוחסן במשך יותר משנה, אבל אנחנו לא בחנו אם ברזולוציה גבוהה של ניאון הכלאה באתרו הוא איבד ידי אחסון ממושך.)
  7. לשטוף עוברים במשך 5 דקות כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBST ב RT. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.
  8. תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
  9. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.

הערה לגבי PFA:
אנו מאחסנים PFA 4% aliquots ב -20 º C (ראה טבלה של ריאגנטים). עבור קיבעון הראשוני, אנחנו רק להשתמש PFA שלא הופשר קודם לכן. עבור הקיבועים הבאים, אנו מרבים להשתמש PFA כי הופשר קודם לכן. קיבוע ראשוני נראה קריטי עבור מכתים מוצלחת עם פרוטוקול זה.

2. Proteinase AND POSTFIXATION

  1. תקציר עם proteinase K (5μg/ml ב PBST) בשעה RT במשך 3 עד 12 דקות כדי permeabilize את העוברים. (זמן הדגירה תלוי בגילו של עוברים כמו שלבים צעירים רגישים יותר. זה גם תלוי אצווה של האנזים.) לקבלת עוברים שלב somitogenesis, אנחנו בדרך כלל permeabilize במשך 3-4 דקות. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
  2. לשטוף בקצרה PBST ולשטוף פעם במשך 5 דקות בתוך PBST.
  3. תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
  4. לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.

3. PREHYBRIDIZATION

  1. דגירה עוברים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב-HYB.
  2. Prehybridize ב-C º 65 במשך שעה לפחות 1 ב HYB +.

4. הכלאה

  1. הסר את כל אבל 50 μl של preHYB, אך הקפד לשמור את העוברים שקוע לחלוטין.
  2. הוספת 1-2 μl של כל riboprobe (digoxygenin ו והעמסת שכותרתו riboprobes) על ידי עוברי ומערבבים בעדינות מצליף את הצינורית. כמות בדיקה הוא בדרך כלל 1-2μl מ תגובה בדיקה 20μl סינתזה.
  3. בהתחשב בכך והעמסת הוא רגיש לאור, צינורות יש לעטוף בנייר אלומיניום או אחרת חשוף לאור מינימלי מרגע זה והלאה.
  4. דגירה עוברים לילה בשעה 65 º C.

5. בדיקה הסרת

ראוי לציין, כי הפתרונות של חומר ניקוי זה חוסר קדימה נקודה. ביעור של חומר ניקוי מופיעה לעזור התגובות מכתים אך גורם העוברים להיות דביק למדי.

  1. הסר את riboprobe.
  2. לשטוף 2 x 30 דקות ב-C º 65 ב formamide/2xSSC 50%.
  3. שטפו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב 2 x SSC.
  4. שטפו במשך 30 דקות 65 מעלות צלזיוס ב 0.2 x SSC.

6. אנטי נוגדנים והעמסת הדגירה

  1. חסום במשך שעה לפחות 1 ב RT ב 500μl של פתרון של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם (ראה טבלה של ריאגנטים).
  2. הוסף את הנוגדן אנטי והעמסת-POD, כפי שסופק על ידי חברת רוש, בדילול 1:500 בפתרון חסימה.
  3. דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
  4. שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.

7. זיהוי של בדיקה והעמסת-מדביקים לו תווית של

  1. דגירה 30-60 דקות פתרון ה-TSA והעמסת פלוס. (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר פרקין אלמר diluent הגברה.) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה. למרבה הצער, התגובה מכתים לא ניתן לנטר חזותית כמו המצע הוא פלורסנט, ואחד יראה פלואורסצנטי ירוק בכל מקום ברחבי התגובה מכתים.
  2. שטפו במשך 10 דקות כל אחד 30%, 50%, 75% ו 100% מתנול ב PBS.
  3. דגירה בתמיסה של 1% H 2 0 2 מתנול במשך 30 דקות כדי להשבית peroxidase הראשון.
  4. שטפי 10 דקות כל אחד 75%, 50% ו - 30% מתנול PBS. לאחר מכן לשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל אחד PBS. חשוב שכל נפגשוhanol להסירו.

הערות על הגברה האות TYRAMIDE:
We have been באמצעות פרקין אלמר ערכות ה-TSA. אנו מוצאים כי Alexa-Tyramide מצעים כתם גם באמצעות פרקין אלמר diluent חיץ הגברה, אבל אנחנו לא נחלו הצלחה באמצעות חיץ מכתים מסופק עם ערכות בדיקות Invitrogen / מולקולרית. לבסוף, מצאנו כי Cy5 הקרינה מסולק על ידי טיפול שלאחר מכן מתנול / H 2 O 2 ואילו והעמסת Alexa ו-647 אינם מושפעים. Cy3 עשוי גם להיות מושפע לרעה את הטיפול מתנול / H 2 O 2 כפי שהוא קשור מבנית Cy5. מסיבה זו, Cy3 ו Cy5 תגובות TSA יש להשתמש רק עבור התגובה מכתים השני ניאון כפול פרוטוקול באתרה.

8. אנטי Digoxygenin נוגדן הדגירה

  1. חסום את העוברים שוב במשך שעה לפחות 1 ב RT בתמיסה של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם.
  2. הוסף את הנוגדן אנטי DIG POD כפי שסופק על ידי רוש בדילול 1:1000 ב לעיל חסימת פתרון
  3. דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
  4. שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.

9. זיהוי של בדיקה Digoxygenin-מדביקים לו תווית של

  1. דגירה 30-60 דקות TSA פלוס Cy5 פתרון (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר diluent הגברה) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה.
  2. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד PBST.

10. PROPIDIUM מכתים יודיד

  1. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל 2 x SSC.
  2. דגירה עוברים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 50 μl 2 x SSCT עם 10 RNAse μl (ריכוז סופי של 100μg/ml).
  3. לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
  4. הכתם עוברים במשך 8 דקות בתמיסה של יודיד propidium 330μg/ml ב 2 x SSC.
  5. לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
  6. תקן 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
  7. לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.

11. הרכבה

  1. דגירה עוברים במשך 10 דקות כל אחד 25% גליצרול ו 50% PBST. נקה לילה גליצרול 75% ב 4 º C.
  2. אנחנו מחלקים את העוברים ואת deyolk ושטוח הר אותם בשקופית מיקרוסקופ. החלמון יכול לייצר הקרינה רקע משמעותי. Dissection הרבה יותר קל אחרי העוברים ניקית ovenight ב gylcerol.

פתרונות:

PBST PBS פלוס 0.1% Tween
SSCT SSC פלוס 0.1% Tween
HYB- 50% לפוראמיד
5xSSC
0.1% Tween-20
HYB + HYB-
5mg/ml torula (שמרים) RNA
50μg/ml הפרין 		RNA torula מוכן ידי עיכול K proteinase של רנ"א עם פנול, לאחר מכן, פנול, כלורופורם, ו כלורופורם extraction.The-RNA הוא זירז ו מומס במים DEPC שטופלו.
1 x חיץ חומצה maleic 150mm חומצה maleic, NaCl 100mm (pH 7.5)

איור 1

באיור 1. תוצאות נציג הר שלם פלורסנט כפול הכלאה באתרה. (AC). תמונות להראות קטע confocal יחיד דרך האזור האחורי של עובר דג הזברה בשלב עשר somite. הנוף הגב עם הקדמי למעלה. מוכתם גרעינים עם יודיד propidium הם בצבע כחול. (א) mRNA deltaC זוהה באמצעות riboprobe digoxygenin שכותרתו ו-TSA Cy5 מגיב. (ב) mRNA עיבד מן הגן her1 זוהה עם riboprobe והעמסת שכותרתו ו-TSA והעמסת מגיב. (ג) תעלות מיזוג ירוק ואדום באופן חד משמעי מזהה אזורים של ביטוי גנים שונים או חופפים של שני גנים. (D, E) פירוט הביטוי her1 הוכחת ברזולוציה גבוהה של הליך זה. לוקליזציה subcellular של mRNA ניתן להבחין בבירור. ראשי חץ להצביע על תא מציג שעתוק פעיל, חשף ידי נקודות של מכתים בגרעין. החצים מצביעים על התא המציג לוקליזציה cytoplasmic של mRNA. (F, G) מכתים פעמיים עבור her1 ו deltaC מגלה התאים לתעתוק שני גנים (חץ לבן), או גן או בנפרד (ראשי חץ אדום וירוק).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול סינתזה בדיקה). היו לנו פחות הצלחה עם פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו כאשר באמצעות בדיקות חלש, אבל זה עשוי להיות אפשרי במקרים מסוימים. יש לנו שילוב בהצלחה ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו עם immunolocalization של β-catenin 3. בעת ביצוע וריאציה זו, אנחנו עושים את HYB-, HYB + ו incubations הכלאה על 55 מעלות צלסיוס במקום 65 מעלות צלזיוס כפי epitopes מופיעים להישמר טוב יותר בטמפרטורה נמוכה יותר. Incubations immunolocalization המבוצעות לאחר התגובות TSA.

מאחר והעמסת שכותרתו בדיקות בדרך כלל חלש יותר בדיקה-digoxygenin שכותרתו עבור אותו הגן, אנחנו בדרך כלל לדמיין את החללית והעמסת שכותרתו הראשון. מקרה אחד שבו אפשר היה רוצה לדמיין את החללית digoxygenin הראשון הוא אם אחד משני הגנים מתבטאת ברמה נמוכה. במקרה זה, אחד עושה digoxygenin-riboprobe עבור הגן חלש כתמים על זה קודם כדי למקסם את האות לרעש. שים לב שאם אתה לדמיין השנייה בדיקה והעמסת, אתה לא צריך לדמיין את החללית digoxygenin עם והעמסת TSA כמו נוגדן אנטי והעמסת תכיר TSA את הכתם כמו גם riboprobe והעמסת שכותרתו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Acknowledgements: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג'ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.

Materials: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at 20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade Roche Group 03115879001 Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at 20°C
Blocking Reagent Roche Group 11096176001 Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at 20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments Roche Group 11426346910 Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments Roche Group 11207739910 As above.
TSA Plus Fluorescein system PerkinElmer, Inc. NEL741001KT Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system PerkinElmer, Inc. NEL745001KT As above
TSA Plus Cyanine3 system PerkinElmer, Inc. NEL744001KT As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) Molecular Probes, Life Technologies T20926 Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at 20°C.
RNase, DNase free Roche Group 11119915001 Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide Molecular Probes, Life Technologies P-3566 Supplied as 1mg/ml solution in water.

References: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G. & Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods 23, 345-58 (2001).
  3. Jülich, D. et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol 286, 391-404 (2005).
  4. Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C. & Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol 9, 523-30 (2007).
  5. Lecuyer, E. et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell 131, 174-87 (2007).

Ask the Author: דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

5 Comments

 I have a quick question, as we don't have a confocal microscope, can I do cryostat section after staining to visulize the signal?  pls reply me at jyhe@ihb.ac.cn. Thank you so much!!!

1

Reply

Posted by: AnonymousApril 20, 2009, 3:07 AM

I have a quick question. I tried to do double in-situ hybryidization with two DIG-labelled probes. The yolk turned very purplish after staining with NBT/BCIP and the expression of only one probe was visualized. However, the expression of the other probe can be visualized when used alone. Any ideas of why this is so and how I can circumvent this ? Thank you.

2

Reply

Posted by: AnonymousSeptember 10, 2009, 10:17 AM

can you send video to me ? jinmeizhao@126.com,Thank you

3

Reply

Posted by: meiNovember 2, 2011, 9:32 AM

Hi,
I didn't understand why and when I have to use the Alexa-tyramide substrate?

4

Reply

Posted by: ANNA G.March 14, 2013, 11:19 AM

The Alexa-tyramide substrate is an option. You do not have to use it. However, we always use the Perkin Elmer amplification diluent buffer, even with the Alexa-tyramide probes. We never achieved good staining using the Invitrogen buffers.

Good luck with your experiment.

5

Reply

Posted by: Scott H.March 14, 2013, 12:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter