फोकल Ca ^{2 +} चिकनी पेशी में क्षणिक जांच

Young, J. S., Amos, R. J., Brain, K. L. Focal Ca²⁺ Transient Detection in Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (28), e1247, doi:10.3791/1247 (2009).

² Ca ⁺ चिकनी पेशी के इमेजिंग सेलुलर तंत्र है कि झिल्ली क्षमता के आंतरिक दुकानों से ^{Ca +} 2 की रिहाई के रूप में इस तरह के बदलाव में परिणाम नहीं हो सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और एकाधिक एक साथ नजर रखी जा कोशिकाओं, उदाहरण के लिए आकलन के लिए अनुमति देता है, में युग्मन syncytial ऊतक. Subcellular Ca ^{2 +} यात्रियों चिकनी पेशी में आम हैं, अभी तक उनके stochastic घटना से देखने का एक बार विस्तृत क्षेत्र पर, कारण एक अंग में समस्याओं की वजह से सही उपाय करने के लिए मुश्किल हैं कि यह अनुबंध करने के लिए प्रवण. इस समस्या पर काबू पाने के लिए, हम इमेजिंग प्रोटोकॉल और विश्लेषण दिनचर्या की एक श्रृंखला के अधिग्रहण और विश्लेषण तो विकसित की है, एक स्वचालित फैशन में, आवृत्ति, और इस तरह की घटनाओं के स्थान आयाम. हालांकि इस दृष्टिकोण के अन्य संदर्भों में लागू किया जा सकता है, हमारे अपने काम का पता लगाने के स्थानीय ^purinergic Ca 2 शामिल submicron संकल्प के साथ ट्रांसमीटर रिहाई का ^पता लगाने के लिए यात्रियों +.

एटीपी autonomic नसों, जहां यह detrusor और वीएएस deferens की चिकनी पेशी पर P2X1 रिसेप्टर्स करने के लिए बांध से एक cotransmitter के रूप में जारी है. Ca ^{2 +} चिकनी पेशी में प्रवेश करती है, ^{purinergic neuroeffector} Ca 2 + यात्रियों (NCTs) में जिसके परिणामस्वरूप. फोकल Ca ^{2 +} यात्रियों को एक तरह से है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर कई फायदे है में neurotransmitter रिहाई के ऑप्टिकल निगरानी की अनुमति देते हैं . बहुत सुधार स्थानिक संकल्प के अलावा, ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग एक साथ कई अलग पहचाना साइटों से ट्रांसमीटर रिहाई की रिकॉर्डिंग की अनुमति के अतिरिक्त लाभ है. इसके अलावा, ध्यान की ऑप्टिकल विमान को बनाए रखने के लिए या लंबे समय रिकॉर्डिंग श्रृंखला के दौरान सही से एक intracellular तेज microelectrode के repositioning के है आसान है.

संक्षेप में, ² Ca ⁺ इमेजिंग के प्रतिदीप्ति के लिए एक विधि उल्लिखित है जो ऊतकों की तैयारी, विवरण, और अधिग्रहण और डेटा का विश्लेषण . हम ऐसे Ca ^{2 +} यात्रियों के विश्लेषण के लिए कई लिपियों का उपयोग रूपरेखा .

भाग 1: ² Ca की तैयारी सूचक ⁺ (ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 AM)

1. ओरेगन ग्रीन BAPTA 488-1 AM पाउडर (50 μg) की एक छोटी राशि के रूप में 500 μl शीशियों में आता है. 40 μl एफ 127 - पाउडर के समाधान, 30 एस के लिए धीरे से मिलाते Pluronic जोड़ें, तो 460 μl PSS जोड़ने के लिए, और 30 एस के लिए धीरे से हिला अंतिम समाधान, 10 सुक्ष्ममापी ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 AM, 4 x 125 μl aliquots प्रदान करता है. -20 सी. प्रकाश और स्टोर करने के लिए जोखिम से बचें

भाग 2: सीए ^{2 +} लोड हो रहा है

1. Ca फ्रीजर (-20 सी) से ^{2 +} सूचक (ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 AM) निकालें और कमरे के तापमान पर पिघलना अनुमति देते हैं.
2. एक टेस्ट ट्यूब और पानी के स्नान में जगह में PSS के 1 मिलीलीटर ले लो. 95% ओ ₂ / 5% प्रति सेकंड 1 के आसपास दिखने बुलबुले के एक दर पर सीओ ₂ के साथ बुलबुला . bubbler करने के लिए टेस्ट ट्यूब, एक डाट के साथ या Parafilm के साथ उदा में सुरक्षित होने की जरूरत है.
3. जानवर से ऊतक टुकड़े करना, और एक Sylgard लाइन पेट्री डिश में, ध्यान संयोजी ऊतक निकालने. चिकनी पेशी अंग प्रकार के चाहे, PSS के हर 10 मिनट की जगह होना चाहिए और ऊतकों को अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए (PSS तीन बार जगह द्वारा जैसे) निम्नलिखित विच्छेदन. वीएएस deferens के लिए: अंग काटने के लिए ऊतक के एक पत्रक का उत्पादन लंबाई तरीके पर विचार करें. मूत्राशय के लिए: मूत्राशय गर्दन (पोस्टीरियर) से longitudinally गुंबद (पूर्वकाल) के शीर्ष करने के लिए खुला है. 8 लंबे मिमी और 1 - 2 detrusor की पृष्ठीय सतह के साथ व्यापक, मिमी, प्रमुख मांसपेशी बंडलों की दिशा में कटौती चार स्ट्रिप्स, 6 तैयार करें.
4. प्लेस 'पूर्व गर्म और bubbled PSS में ऊतक dissected.
5. 10 सुक्ष्ममापी ओरेगन 488 ग्रीन BAPTA-1 परखनली AM 125 μl जोड़ें और हाथ से एक छोटे से हिला दे, मिश्रण.
6. बुदबुदाती और छोड़ देते हैं, पन्नी के साथ कवर पुनरारंभ. समय के लिए पर्याप्त ऊतक Ca ^{2 +} सूचक और चिकनी पेशी परत के ऊतक मोटाई के आकार के साथ बदलता रहता है लेने के लिए लेता है. उदाहरण के लिए: 120 मिनट (चूहा detrusor, माउस वीएएस deferens) से 70 मिनट (माउस detrusor, चूहे anococcygeus).

भाग 3: माइक्रोस्कोपी के लिए ² Ca ⁺ लोड 'ऊतकों की तैयारी

ऊतक की सावधानी से लगाए आवश्यक है क्रम में ऊतक का सहज आंदोलन (अपेक्षाकृत बरकरार ऊतक से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की इमेजिंग के एक संपत्ति) को कम करने और इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त साइट के स्थान (ऊतक के एक फ्लैट टुकड़ा के रूप में किया जा सकता है की सुविधा तीन के बजाय दो आयामों) में सर्वेक्षण किया.

1. Bubbled PSS में ऊतकों को कम से कम 5 मिनट के लिए कुल्ला.
2. Sylgard पंक्तिवाला तैयारी पकवान में पर्वत, ऊतक (थोड़ा) एक फ्लैट शीट के रूप में खींच. लंबे समय 'पिन उद्देश्य है कि खरोंच सकता का उपयोग करने से बचें,' पिन 'के रूप में 25-50 सुक्ष्ममापी व्यास चांदी के तार के बजाय कम लंबाई का उपयोग करें और एक कोण पर सम्मिलित है.
3. खुर्दबीन मंच पर तैयारी पकवान स्थिति, करने के लिए सुनिश्चित करें कि PSS पकवान की Sylgard लाइन क्षेत्र से बच नहीं (के रूप में यह हो सकता है एक बड़े PSS है, जब superfusion शुरू होता है में शामिल किया गया जा रहा है क्षेत्र के लिए नेतृत्व) सावधान किया जा रहा है.
4. आदेश में पंप पर स्विच PSS के साथ तैयारी superfuse करने के लिए. प्रति घंटे 100 मिलीलीटर की एक दर अक्सर कार्यरत है.
5. हीटर इकाई पर स्विच करें.
6. प्रवाह और बहिर्वाह ट्यूबों और तापमान जांच तैयारी पकवान (धातु पट्टी करने के लिए उसके आधार पर चुंबक द्वारा प्रत्येक affixing) पर रखें. बहिर्वाह ट्यूब की टिप की ऊंचाई PSS की गहराई का निर्धारण करेगा. सुनिश्चित करना है कि वास्तव में बहिर्वाह PSS हटाने है (के रूप में यह कभी कभी शुरू नहीं करता है) सावधान रहो.
7. हीटर इकाई पर तापमान सेट करने के लिए वांछित तापमान, जैसे सी. 33-35 तक पहुंच
8. ऊतक कम से कम 10 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें.

भाग 4: साइट का चयन छवि

उत्तेजना रोशनी करने के लिए एक्सपोजर सूचक photobleach जाएगा, तो एक समय में अधिक से अधिक एक कुछ सेकंड के के लिए का उपयोग कर से बचने के.

1. (10x या 20x) के एक कम शक्ति के उद्देश्य के साथ एक नीली बत्ती के साथ epifluorescence रोमांचक उपयोग करते हैं, चिकनी पेशी देखने के लिए और एक उपयुक्त क्षेत्र की निगरानी की पहचान. आंदोलन (जो कम से कम होना चाहिए) और क्षेत्र में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की संख्या: एक साइट के आधार पर लेने की कोशिश करें. तेज 'संरचनाओं' छवि का पता लगाने एल्गोरिथ्म में झूठी सकारात्मक 'के एक उच्च संख्या का कारण हो सकता है, तो (उदाहरण के लिए) interspersed उपकला कोशिकाओं या fibroblasts की बड़ी संख्या के साथ साइटों से बचने के.
2. एक उच्च शक्ति उद्देश्य (40x) के लिए स्विच.
3. मंच या ऑप्टिकल अक्ष घुमाएँ तो चिकनी मांसपेशी कोशिका (ओं) को क्षैतिज झूठ (तेजी से स्कैन अक्ष यानी समानांतर).

भाग 5: confocal माइक्रोस्कोपी

के विवरण कैसे confocal खुर्दबीन 'सेट' प्रत्येक खुर्दबीन प्रकार के लिए विशिष्ट हैं, लेकिनमहत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं. संकल्प और क्षेत्र के आकार (जो दोनों के गति के साथ कारोबार बंद कर रहे हैं) (5 हर्ट्ज की ^{सबसे Ca} + 2 यात्रियों के लिए न्यूनतम आवश्यकता है ) गति: निम्नलिखित प्रोटोकॉल के कुछ एक Leica SP2 के ईमानदार confocal खुर्दबीन के लिए विशिष्ट है. , या 13.5 हर्ट्ज (256 x 64 पिक्सल, लगभग 100 x 25 सुक्ष्ममापी) 100 फ्रेम श्रृंखला 5 (लगभग 100 x 100 सुक्ष्ममापी 256 x 256 पिक्सल) हर्ट्ज में अधिग्रहीत: एक ठेठ प्रोटोकॉल है. स्कैनिंग सिर करने के लिए द्वि - directionally कदम (अधिग्रहण की गति को अधिकतम करने के) और प्रति पंक्ति 1000 हर्ट्ज पर अधिग्रहण करने के लिए सेट.

1. एक हवादार डिस्क 'pinhole बंद करें.
2. इस मूल्य चमक और photobleaching के बीच व्यापार बंद है, AOTF पर लेजर (488 एनएम) 25 और 35% के बीच सत्ता सेट करें. (बाद लंबे समय रिकॉर्डिंग के दौरान एक विशेष समस्या जा रहा है.)
3. 'इलाज' के प्रति छह साइटों - साइट प्रति छह श्रृंखला, और चार मोल. यह वही छह (यानी 'नियंत्रण') पूर्व दवा और दवा के बाद साइटों पर नजर रखने के उद्देश्य आम है, हालांकि महत्वपूर्ण photobleaching experimenter इस से विचलित करने के लिए कारण हो सकता है.
4. यह Ca के साथ ^{2 +} इमेजिंग आवश्यक है कि 'समय नियंत्रण' प्रदर्शन कर रहे हैं.

भाग 6: विश्लेषण के लिए तैयार

1. डाउनलोड करें और छवि से जम्मू स्थापित: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. मंच विशेष संस्करण डाउनलोड करें, और तब http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar से नवीनतम imageJ.jar फ़ाइल डाउनलोड, पुरानी फाइल की जगह से नवीनतम संस्करण के लिए अद्यतन. एप्पल मैक उपयोगकर्ताओं: अगर यह धीरे धीरे चलता है, सुनिश्चित करें कि आप जावा आभासी (JVM) एप्पल (http://www.apple.com/macosx/features/java/) से उपलब्ध मशीन के नवीनतम संस्करण का उपयोग कर रहे हैं.
2. से Excel_writer.jar डाउनलोड: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html और [निर्देशिका]> जार निर्देशिका प्लगइन्स में स्थापित है.
3. ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class: Plugins निर्देशिका में निम्नलिखित फाइल कॉपी. इन लिपियों के प्रत्येक स्थापित plugins का उपयोग [मेनू] मैक्रोज़>> स्थापित ... ImageJ के समारोह में.
4. हम जो एक एकल सॉफ्टवेयर के भीतर देखा जा सकता है फिल्म 'के रूप में प्रत्येक श्रृंखला उत्पन्न के लिए एक Leica SP2 के confocal खुर्दबीन, सॉफ्टवेयर (Leica LCS) का उपयोग करते हैं, लेकिन के रूप में व्यक्तिगत फ्रेम बचाता. श्रृंखला में फ्रेम का पुनर्निर्माण करने के लिए: (i) यह सुनिश्चित करें कि सभी 'फ्रेम' खंगाला जा करने के लिए एक एकल फ़ोल्डर (जैसे 'DataFolder> झगड़े') में हैं. (Ii) Plugins [मेनू] मैक्रोज़>> Leica_SP2_Stacker का चयन करें. रूट निर्देशिका का चयन करें (जैसे 'DataFolder'). ड्रॉप - डाउन सूची (जैसे 'झगड़े /) से इच्छित फ़ोल्डर का चयन करें. एक आउटपुट निर्देशिका का चयन करें या एक नया एक (जैसे 'DataFolder> ढेर') उत्पन्न. स्क्रिप्ट तो व्यक्तिगत तख्ते से श्रृंखला पुनर्निर्माण होगा.

भाग 7: आंदोलन के लिए सही

हालांकि imaged साइट के आंदोलन के साथ अच्छा लगाए कम से कम किया जा सकता है और समान रूप से बढ़ाकर ऊतक, कुछ चिकनी मांसपेशियों अंगों प्रदर्शन सहज संकुचन है कि सावधान अकेले लगाए नहीं किया जा समाप्त कर दिया जा सकता है. यहाँ हम एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध एल्गोरिथ्म है कि aligns से मेल खाता है या एक श्रृंखला के भीतर फ्रेम का उपयोग का वर्णन.

1. डाउनलोड का 'StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) और 'TurboReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Plugins निर्देशिका का उपयोग प्लगइन्स में प्रत्येक स्थापित मैक्रोज़>> स्थापित ...
3. (फ़ाइल> ओपन ...) संसाधित किया जा ढेर लोड और फिर एक फ्रेम है कि स्पष्ट रूप से ब्याज के क्षेत्र से पता चलता है करने के लिए कदम. अन्य फ्रेम इस संदर्भ फ्रेम करने के लिए गठबंधन किया जाएगा.
4. Plugins> ढेर> StackReg. अलग 'रूपांतरण' में से प्रत्येक की कोशिश करो (यानी अनुवाद, कठोर शारीरिक, स्केल्ड रोटेशन, affine) निर्धारित करने के लिए क्या सबसे प्रभावी है. (इसके अलावा विवरण: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

भाग 8: कण का पता लगाने एल्गोरिथ्म

के लिए प्रत्येक 'साइट' imaged, कारकों को अलग अलग होंगे ^कि 2 Ca ^{यात्रियों} + का पता लगाने के प्रभावित . प्रत्येक साइट ('कण मापदंडों विस्तृत नीचे) के कुछ गुणों को मापने के द्वारा, पता लगाने की प्रक्रिया में मदद की है. इस प्रकार प्रत्येक साइट के लिए, एक की गणना करता के लिए दहलीज घटाया ',' दहलीज अनुपात के लिए 'और' सेल बढ़त दहलीज '.

1. Plugins मेनू [] मैक्रोज़>> ... स्थापित करें और 'JNCT0.08Release.ijm' का चयन करें.
2. Plugins [मेनू] मैक्रोज़>> लोड ढेर (शॉर्टकट: एल). एक श्रृंखला का चयन करें और कण मापदंडों की गणना:
   1. ए थ्रेसहोल्ड के लिए घटाया (= पृष्ठभूमि)
3. तुम क्या 'पृष्ठभूमि' विश्वास पर एक आयताकार रॉय का चयन करें.
4. उपाय (शॉर्टकट: मीटर). नीचे नोट मतलब है.
   1. ज. अनुपात के लिए गिना दहलीज
5. एक आयताकार चुनेंसेल (एस) के एक ऑप्टिकली फ्लैट के आसपास के क्षेत्र आरओआई.
6. उपाय (शॉर्टकट: मीटर). नोट नीचे मतलब है और मानक विचलन.
7. एक और दो बार दोहराएँ या आप एक बार में तीन बक्से 'पारी' दबाकर आकर्षित कर सकते हैं.
8. गणना और अनुपात के लिए नीचे नोट दहलीज = x 32 (+ एसडी मतलब / 1), तीन से मानों औसत साइटों / replicates.
   1. सी. सेल बढ़त दहलीज
9. छवि के ढेर>> परियोजना जेड ... प्रक्षेपण प्रकार चुनें: 'औसत तीव्रता'
10. छवि>> थ्रेसहोल्ड समायोजित करें.
11. काले और सफेद का चयन करें.
12. 'के अंतर्गत' परिभाषित (ऊपरी स्लाइडर) सीमा और नीचे संगत मान (सही करने के लिए स्लाइडर के) ध्यान दें. केवल काले क्षेत्रों में होने वाली घटनाओं को गिना जाएगा.
13. 'रीसेट' पर क्लिक करें.
14. ढेर विश्लेषण (शॉर्टकट: 2)
15. इस चरण में सिर्फ एक श्रृंखला का चयन करें, 'पहली फ़ाइल' यानी 'अंतिम फ़ाइल' ही होना चाहिए.
16. घटाया लिए, और अनुपात के लिए 'सेल बढ़त दहलीज' 'दहलीज' दहलीज 'का मान दर्ज करें. उनके डिफ़ॉल्ट मानों पर अन्य सेटिंग्स छोड़ दें.
17. एल्गोरिथ्म एक फलक दोहरी खिड़की में जो संसाधित श्रृंखला बाईं तरफ दिखाया गया है और सही पर मूल का उत्पादन होगा. ध्यान से इस के माध्यम से जाने के लिए झूठी सकारात्मक और अवसरों पर जो घटनाओं, आंख से दिखाई नहीं पाया गया है की संख्या का आकलन. ² Ca की एक और अधिक सटीक पता लगाने के ^लिए + यात्रियों यह थोड़ा 'कण पैरामीटर' के कुछ समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. हालांकि इस प्रक्रिया एक छोटे से 'हिट और याद' लग पहला प्रयास पर, एक जल्दी पैरामीटर क्या कर रहे हैं कुंजी के रूप में महसूस हो जाता है.
18. प्रत्येक श्रृंखला के लिए, एल्गोरिथ्म एक Excel फ़ाइल का उत्पादन है कि पता चला घटना के विवरण विशेषताओं (जैसे आयाम, क्षेत्र, और स्थिति के रूप में). 'झूठी सकारात्मक' - हाथ से हटाया जा सकता इस Excel फ़ाइल से, छवि फ़ाइलें है कि एल्गोरिथ्म (जैसे 8.17 कदम) outputs के समीक्षा द्वारा की पहचान की.

फ्लोरोसेंट Ca ² के विकल्प सूचक ⁺

(Ii) ² CA में शारीरिक परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है ⁺ एकाग्रता, ओरेगन 488 BAPTA-1 AM ² CA के रूप ⁺ सूचक चुना गया था क्योंकि यह (मैं) अन्य सामान (जैसे Fluo-4 और कैल्शियम ग्रीन) ^{संकेतक} 1 की तुलना में उज्जवल है ग्रीन (iii) भार कई चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, चिकनी पेशी सेल युग्मन के लिए नजर रखी जा सक्षम, intracellular ^Ca 2 ^{एकाग्रता} + ^{[ca 2} +] मैं (वीएएस के जैसे ^deferens 2) के लिए इसी तरह ^की एक परिमाण के एक _{कश्मीर} घ के साथ हालांकि, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 AM एक गैर - ratioable Ca ^{2 +} सूचक है, और इस तरह के रूप में आसानी से नहीं हो निरपेक्ष निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया ^जा सकता ^है. _[2 Ca +] मैं. इसके अलावा, यह भी ^{Ca 2} + यदि वर्तमान उच्च सांद्रता में बफर कर सकते हैं और ^{[2 Ca} _+] मैं उच्च आयाम में परिवर्तन के साथ संतृप्त हो जाता है.

सहज सिकुड़ना के निषेध

चिकनी मांसपेशियों अंगों की सहज सिकुड़ना pharmacologically कम किया जा सकता है, जैसे ^दो Ca ^{+ +} एल प्रकार Ca के माध्यम से ² चैनल (उदाहरण के द्वारा: ^तीन nifedipine, diltiazem ⁴⁾ आंदोलन अवरुद्ध द्वारा. नोट है कि इन दवाओं बहुत के आयाम पूरे सेल ^{Ca 2} + / चमक यात्रियों कम हो जाएगा .

वीएएस के संकुचन मुख्य रूप से purinergic और noradrenergic neurotransmission का एक संयोजन से परिणाम deferens. फोकल ² Ca ⁺ यात्रियों में इस ऊतक हैं, तथापि, noradrenergic रिसेप्टर नाकाबंदी (जैसे α _एक adrenoceptor, prazosin ⁵⁾ तो आंदोलन फोकल Ca ^दो यात्रियों ⁺ को प्रभावित किए बिना कम किया जा सकता है के लिए असंवेदनशील है.

वैकल्पिक रूप से, संकुचन ⁶ wortmannin द्वारा मायोसिन प्रकाश श्रृंखला kinase उदाहरण के निषेध के माध्यम से 'अनुप्रवाह' रोका सकता है.

निष्कर्ष

Submicron संकल्प Ca ⁺ प्रतिदीप्ति ² निगरानी neurotransmitter रिहाई ^5,7 के बाद junctional प्रभाव का अध्ययन करने और Ca ² की रिहाई ⁺ आंतरिक स्टोर (जैसे 'स्पार्क्स ⁸⁾ से एक शक्तिशाली तकनीक है. Ca ² के विश्लेषण ⁺ पद्धति का उपयोग कर यात्रियों को यहाँ उल्लिखित वाणिज्यिक छवि विश्लेषण उपलब्ध संकुल की तुलना में लागत प्रभावी है और कस्टम लिखा ImageJ के लिए जावा plugins के माध्यम से दर्जी विश्लेषण की अनुमति देता है है.

प्रयास करने के लिए इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या और उनकी पीड़ा को कम किए गए थे, सभी प्रयोगों बाहर ब्रिटेन पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 और यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक 86/09/EEC के अनुसार किए गए.

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