Focal Ca ^{2 +} Detecção de transitórios no músculo liso

Young, J. S., Amos, R. J., Brain, K. L. Focal Ca²⁺ Transient Detection in Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (28), e1247, doi:10.3791/1247 (2009).

Ca ^{2 +} imagens do músculo liso fornece insights sobre os mecanismos celulares que podem não resultar em mudanças de potencial de membrana, como a liberação de Ca ^{2 +} das lojas internas, e permite que várias células para ser monitorados simultaneamente para avaliar, por exemplo, o acoplamento em tecido sincicial. Subcelulares Ca ^{2 +} transientes são comuns no músculo liso, mas são difíceis de medir com precisão, devido aos problemas causados ​​pela sua ocorrência estocástica, sobre um campo de visão amplo, muitas vezes, em um órgão que propensos a contrair. Para ultrapassar este problema, temos desenvolvido uma série de protocolos de imagem e rotinas de análise de adquirir e, em seguida, analisar, de forma automatizada, a localização, freqüência e amplitude de tais eventos. Embora essa abordagem pode ser aplicada em outros contextos, o nosso próprio trabalho envolve a detecção de locais purinérgicos Ca ^{2 +} transitórios para a localização de liberação do transmissor com resolução submicron.

ATP é liberado como um cotransmitter de nervos autônomos, onde se liga a receptores P2X1 sobre o músculo liso do detrusor e canal deferente. Ca ^{2 +} entra no músculo liso, resultando em purinérgicos Neuroefetora Ca ^{2 +} transientes (NSTI). A focal Ca ^{2 +} transientes permitam o monitoramento óptico da liberação de neurotransmissores de uma forma que tem muitas vantagens sobre eletrofisiologia. Além da resolução espacial muito melhorada, a gravação óptica tem a vantagem adicional de permitir a gravação da liberação do transmissor de muitos locais distintos simultaneamente. Além disso, o plano óptico de foco é mais fácil de manter ou corrigir durante a gravação longa série que é o reposicionamento de um microeletrodo intracelular afiada.

Em resumo, um método para geração de imagens de Ca ^{2 +} fluorescência é descrito que detalha a preparação do tecido, e na aquisição e análise de dados. Destacamos o uso de vários scripts para a análise de Ca ^{2 +,} tais transientes.

Parte 1: Preparação do Ca ^{2 +} indicador (Oregon Verde 488-BAPTA 01:00)

1. Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 vem em frascos de 500 mL de uma pequena quantidade (50 mg) de pó. Adicionar 40 mL PLURONIC F-127 solução para o pó, agitando suavemente durante 30 s, em seguida, adicione 460 mL PSS, e agitar suavemente por 30 s. A solução final, 10 mM Oregon Verde 488 BAPTA-01:00, fornece 4 x 125 mL alíquotas. Evitar a exposição à luz e armazenar a -20 C.

Parte 2: Ca ^{2 +} carga

1. Remover o Ca ^{2 +} indicador (Oregon Verde 488-BAPTA 01:00) a partir do freezer (-20 C) e deixar descongelar em temperatura ambiente.
2. Tomar 1 ml de PSS em um tubo de ensaio e coloque em banho-maria. Bolha com 95% O ₂ / 5% CO ₂ a uma taxa de cerca de 1 bolha aparecendo por segundo. O borbulhador precisa ser protegido em tubo de ensaio, por exemplo, com uma rolha ou com Parafilm.
3. Dissecar os tecidos do animal e, em uma placa de Petri Sylgard-alinhado, remova cuidadosamente tecido conjuntivo. Independentemente do tipo de músculo liso do órgão, PSS deve ser substituído a cada 10 minutos e tecidos devem ser bem lavados (por exemplo, substituindo o PSS três vezes) dissecção seguinte. Para o canal deferente: considerar cortar o órgão de comprimento maneiras de produzir uma folha de tecido. Para a bexiga urinária: aberto longitudinalmente a partir do colo da bexiga (posterior) para o topo da cúpula (anterior). Prepare quatro tiras, 6-8 mm de comprimento e 1-2 mm de largura, ao longo da superfície dorsal do detrusor, o corte na direção dos feixes musculares dominante.
4. Lugar dissecados tecido na "pré-aquecida e com bolhas 'PSS.
5. Adicionar 125 mL de 10 mM Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 de tubo de ensaio e dar um pouco agitação, à mão, para misturar.
6. Retomar a borbulhar e deixe, coberto com papel alumínio. O tempo necessário para o tecido suficiente para assumir o Ca ^{2 +} indicador varia de acordo com o tamanho do tecido ea espessura da camada de músculo liso. Por exemplo: 70 mins (mouse detrusor, anococcygeus rato) a 120 minutos (detrusor de rato vas, deferente do rato).

Parte 3: Preparando o 'Ca ^{2 +} carregado' de tecidos para microscopia

Cuidado pinagem do tecido é necessário para minimizar o movimento espontâneo do tecido (a propriedade de imagem de células musculares lisas do tecido relativamente intacta) e para facilitar a localização de um local adequado para geração de imagens (como um pedaço de tecido pode ser pesquisados ​​em duas dimensões, em vez de três).

1. Lave o tecido em PSS borbulhava por pelo menos 5 minutos.
2. Montagem em Sylgard alinhadas prato preparação, alongamento do tecido (um pouco) para formar uma folha plana. Evite a utilização de 'pins' que podem riscar o objetivo, uso comprimentos curtos, em vez de 25-50 fio de prata mM diâmetro como 'pinos' e inserir em um ângulo.
3. Posicione o prato preparação no estágio do microscópio, tomando cuidado para assegurar que o PSS não escapa da área Sylgard-alinhados do prato (como isso pode levar a uma grande área a ser coberta no PSS, quando o superfusão começa).
4. Ligue a bomba, a fim de superfuse a preparação com PSS. A taxa de 100 ml por hora é freqüentemente empregada.
5. Ligar o aparelho aquecedor.
6. Coloque os tubos de entrada e saída e sonda de temperatura no prato preparação (aposição cada um para a tira de metal pelo ímã em sua base). A altura da ponta do tubo de saída irá determinar a profundidade do PSS. Tenha cuidado para garantir que a saída é realmente remover PSS (como às vezes não inicialmente).
7. Regule a temperatura do aquecedor na unidade para atingir a temperatura desejada, por exemplo, 33-35 C.
8. Permitir que o tecido a estabilizar durante pelo menos 10 minutos.

Parte 4: Selecção do local para a imagem

Exposição à iluminação de excitação vai photobleach o indicador, portanto evite usar por mais de alguns segundos de cada vez.

1. Com um objectivo de baixa potência (10x ou 20x) uso de epifluorescência, emocionante, com uma luz azul, para ver o músculo liso e identificar uma região adequada para monitor. Tente escolher um site baseado em: movimento (que deve ser mínima) eo número de células musculares lisas no campo. "Estruturas" brilhante pode causar um elevado número de "falsos positivos" no algoritmo de detecção de imagem, de modo a evitar sites com grande número de (ex) intercaladas células epiteliais ou fibroblastos.
2. Mudar para um objetivo maior potência (40x).
3. Gire o palco ou o eixo óptico para que a célula muscular lisa (s) está horizontal (paralela ao eixo ie varredura rápida).

Parte 5: A microscopia confocal

Os detalhes de como o microscópio confocal é 'set up' são específicos para cada tipo de microscópio, masas principais considerações são: velocidade (mínimo de 5 Hz é necessária para a maioria dos transientes de Ca ^{2 +),} a resolução e tamanho de campo (os quais são negociados-off com a velocidade). Alguns dos seguinte protocolo é específico para um SP2 Leica microscópio confocal ereta. Um protocolo típico é: 100 séries de quadros, adquiridos a 5 Hz (256 x 256 pixels; aproximadamente 100 x 100 mm.) Ou 13,5 Hz (256 x 64 pixels; aprox 100 x 25 mm.). A cabeça de leitura definido para mover bi-direcional (para maximizar a velocidade de aquisição) e adquirir a 1000 Hz por linha.

1. Fechar o pinhole para um "disco arejado.
2. Definir a potência do laser (488 nm) entre 25 e 35% sobre o AOTF; este valor é um trade-off entre o brilho eo fotobranqueamento. (O último a ser um problema em particular durante as gravações de comprimento.)
3. Adquirir seis séries por site, e 4-6 sítios por 'tratamento'. É comum a finalidade de monitorar os mesmos seis sítios pré-droga ("controle", por exemplo) e pós-droga, embora fotobranqueamento significativas pode causar o experimentador a desviar-se disso.
4. É essencial com Ca ^{2 +} imagem que "controla o tempo" são executadas.

Parte 6: Preparação para a análise

1. Baixe e instale J Imagem de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Baixe a versão específica da plataforma, e então atualizar para a versão mais recente baixando o arquivo mais recente imageJ.jar de http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, substituindo o arquivo antigo. Utilizadores da Apple Mac: se ele é executado lentamente, certifique-se que você está usando a versão mais recente do Java Virtual Machine (JVM) disponível a partir de Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Download Excel_writer.jar de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e instalar na Plugins [diretório] diretório jar>.
3. Copie os seguintes arquivos no diretório Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Instalar cada um desses scripts usando o Plugins [Menu]> Macros> Instale ... função do ImageJ.
4. Nós usamos uma Leica SP2 microscópio confocal, o software (Leica LCS) para que gera cada série como um único "filme" visível dentro do software, mas economiza como quadros individuais. Para reconstruir quadros em série: (i) Certifique-se que todos os 'frames' de ser reconstruído estão em uma única pasta (por exemplo 'DataFolder> Tiffs'). (Ii) Selecione Plugins [Menu]> Macros> Leica_SP2_Stacker. Selecione o diretório raiz (por exemplo 'DataFolder'). Selecione a pasta desejada na lista drop-down ("Tiffs / ', por exemplo). Selecione um diretório de saída ou gerar uma nova ("DataFolder> Stacks ', por exemplo). O script será então reconstruir série de quadros individuais.

Parte 7: Correção para o movimento

Embora o movimento do site com imagens podem ser minimizados com a fixação boa e tecido uniformemente esticada, alguns órgãos do músculo liso apresentam contrações espontâneas que não pode ser abolido pelo cuidado pinagem sozinho. Aqui nós descrevemos o uso de um algoritmo livremente disponível que alinha ou fósforos frames dentro de uma série.

1. Download 'StackReg "(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) e' TurboReg" (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Instale cada um para o diretório Plugins utilizando o Plugins> Macros> Instale ...
3. Coloque uma pilha para ser processado (File> Open ...) e depois passar para um quadro que mostra claramente o campo de interesse. Outros quadros serão alinhados a este quadro de referência.
4. Plugins> Pilhas> StackReg. Tente cada um dos diferentes "Transformações" (tradução, corpo rígido, rotação Scaled, Affine) para determinar o que é mais eficaz. (Mais detalhes: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Parte 8: algoritmo de detecção de partículas

Para cada 'site' com imagens, os fatores variarão que afetam a detecção de transientes de Ca ^{2 +.} Ao medir certas propriedades de cada site ("parâmetros de partículas" - abaixo detalhada), o processo de detecção é facilitada. Assim, para cada local, calcula-se "limite para subtraído", "limite para a relação" e "limiar limite da célula.

1. Plugins [Menu]> Macros> Instalar ... e selecione 'JNCT0.08Release.ijm'.
2. Plugins [Menu]> Macros pilha de carga> (atalho: l). Selecionar uma série de partículas e calcular parâmetros:
   1. a. Limiar para subtraído (fundo =)
3. Selecione um ROI retangular sobre o que você acredita ser 'background'.
4. Medida (atalho: m). Anote MEAN.
   1. b. Limite de cálculo para o rácio
5. Selecione um retangularROI em torno de uma área plana opticamente da célula (s).
6. Medida (atalho: m). Nota DESVIO baixo médio e padrão.
7. Repita mais duas vezes, ou você pode desenhar três caixas de uma vez pressionando 'Shift'.
8. Calcular e anotar limite para a relação = (1 + SD / média) x 32, com média de valores das três repetições / sites.
   1. c. Limiar limite da célula
9. Image> Pilhas> Z projeto ... Escolha o tipo de projeção: 'intensidade média'
10. Image> Adjust> Limiar.
11. Selecione em preto e branco.
12. Definir "em" (barra superior) limite e anotar o valor correspondente (à direita da barra). Apenas os eventos que ocorrem nas regiões negras serão contadas.
13. Clique em 'reset'.
14. Analisar stacks (atalho: 2)
15. Selecionar apenas uma série nesta fase, ou seja, o arquivo 'primeiro' e 'último arquivo "deve ser o mesmo.
16. Digite os valores de 'limiar para subtraído "," limite para a relação "e" limiar limite da célula. Deixe as outras configurações em seus valores padrão.
17. O algoritmo produz uma vidraça dupla em que a série processada é mostrado à esquerda eo original do lado direito. Cuidado passar por isso para avaliar o número de falsos positivos e as ocasiões em que os eventos, visível a olho nu, não foram detectados. Para obter uma maior precisão na detecção de transientes de Ca ^{2 +,} pode ser necessário ajustar ligeiramente alguns dos "parâmetros de partículas". Embora o processo pode parecer um pouco 'bater e perder "na primeira tentativa, rapidamente fica uma sensação como a que parâmetros são fundamentais.
18. Para cada série, o algoritmo produz um arquivo de Excel que detalha características do evento detectado (como área de amplitude, e posição). "Falsos positivos" - identificado por revisar os arquivos de imagem que as saídas de algoritmo (por exemplo, passo 8.17) - pode ser afastado, à mão, a partir deste ficheiro Excel.

Escolha de fluorescentes Ca ^{2 +} indicador

Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 foi escolhido como o Ca ^{2 +} indicador porque (i) é brilhante em comparação com outros indicadores (por exemplo, Fluo-4 e Verde de cálcio) ^1, (ii) é sensível a mudanças fisiológicas na concentração de Ca ^{2 +} com um _d K de magnitude similar ¹ para o Ca ^{2 +} intracelular concentração [Ca ^{2 +]} i (por exemplo, de canais deferentes ^2), (iii) carrega muitas células do músculo liso, permitindo que células do músculo liso de acoplamento a ser monitorado. No entanto, Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 é um não-ratioable Ca ^{2 +} indicador, e como tal não pode ser facilmente utilizado para determinar o absoluto [Ca ^{2 +]} _i. Além disso, pode também buffer de Ca ^{2 +} se presente em altas concentrações e torna-se saturado com mudanças na amplitude de alta [Ca ^{2 +]} _i.

Inibição da contratilidade espontânea

A contratilidade espontânea de órgãos do músculo liso podem ser reduzidos farmacologicamente, como através do bloqueio da movimentação de Ca ^{2 +} através de L-type Ca ^{2 +} canais (por exemplo: nifedipina ^3; diltiazem ^4). Note-se que estas drogas irá reduzir muito a amplitude de toda célula Ca ^{2 +} flashes / transientes.

Contração dos vasos deferentes resulta de uma combinação de neurotransmissão principalmente purinérgicos e noradrenérgicos. Focal Ca ^{2 +} transientes neste tecido são, no entanto, insensível ao bloqueio dos receptores noradrenérgicos (por exemplo, α adrenoceptor _1, por prazosin ⁵⁾ para o movimento pode ser reduzida sem afetar focal Ca ^{2 +} transientes.

Alternativamente, a contração pode ser impedido "a jusante" através da inibição da miosina quinase de cadeia leve por exemplo, por wortmannin ^6.

Conclusões

Monitoramento Ca ^{2 +} fluorescência em submicron resolução é uma técnica poderosa para estudar os efeitos pós-juncional da liberação de neurotransmissores ^5,7 e liberação de Ca ^{2 +} das lojas internas (por exemplo, "faíscas" ^8). A análise dos transientes de Ca ^{2 +} utilizando a metodologia descrita aqui é custo-efetiva em comparação com comercialmente disponíveis pacotes de análise de imagem e permite tailor-made análise através de plugins personalizados escritos em Java para ImageJ.

Foram feitos esforços para minimizar o número de animais utilizados eo seu sofrimento, todos os experimentos foram realizados de acordo com os Animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 e Comunidades Europeias Directiva do Conselho 86/09/EEC.

Wellcome Trust forneceu apoio financeiro (Prêmio VIP para JSY e 074128 Bolsa de Investigação para KLB). Conselho de Pesquisa Médica Studentship para RJA

Leica_SP2_Stacker, um algoritmo usado para importar TIFFs para 'reconstrução' em uma série, é baseado em Leica_tiff_sequence, um plugin para ler Leica SP2 TIFFs no ImageJ, desenvolvido por Tony Collins e usado com sua permissão.

( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg e TurboReg, algoritmos utilizados para corrigir o movimento do tecido, são baseados em Th venaz e colegas (1998) ^9.

Excel_writer.jar foi escrito por Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).

JNCT0.08JoVE.ijm, o algoritmo de detecção de partículas, é baseado em um algoritmo escrito por Cérebro KL e detalhado anteriormente ^5.

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4. Heppner, T.J., Bonev, A.D., Nelson, M.T. Elementary purinergic Ca²⁺ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
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