عبارة في الدماغ : تشريح العين الرئيسيات

الجزء 1 : قبل معالجة الأنسجة

1. وينبغي أن الأنسجة perfused جيدا مع بارافورمالدهيد ، غلوتارالدهيد ، أو الفورمالين. ويمكن تحقيق ذلك من خلال نضح transcardial القياسية المستخدمة عادة لحصاد الأجهزة الأخرى. فمن المستحسن أن تكون التضحية بعد فترة وجيزة حقن العينين تثبيتي فقط تحت العدسة وتخزينها في تثبيتي.
2. في هذه الدراسة كان مخدرا بعمق هذا الموضوع مع هيدروكلوريد الكيتامين (10 ملغم / كغم ، IM) ، الموت الرحيم مع جرعة زائدة من (الرابع 25 ملغ / كلغ ،) والصوديوم بنتوباربيتال perfused transcardially مع PBS 0،1 M حتى exsanguinated تماما. ويعقب ذلك من خلال حل بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق (~ 1 ليتر).

الجزء 2 : إزالة مقلة العين من تجويف المداري

1. لتسهيل الوصول إلى مقلة العين ينصح أولا إزالة المخ. بمجرد إزالة الدماغ والعظام المدار رقيقة الجدران واضح وضوح الشمس. استخدام رقاقة العظام rongeurs ببطء بعيدا جدار المدار. قطع بعيدا عضلات العين مع مشرط وإزالة النسيج الضام من مقلة العين. قطع بعناية في العصب البصري ، ويمكن استخدام هذه الدراسات في المجهر الالكتروني. وينبغي الآن مقلة العين ستصدر من تجويف المداري.

الجزء 3 : تشريح شبكية العين من فنجان العين

1. مكان العين في طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني للحفاظ على شبكية العين من الجفاف. شنت مجهر تشريح أو جدول المكبرة يقف الخفيفة مفيدة في التشريح ، ولكن ليس ضرورة. إزالة القرنية عن طريق قطع الصلبة عن كثب لمحيط القرنية على مستوى مشرشر ORA مع زوج من مقص الربيع وإزالة العدسة مع ملقط.
2. استخدام الفرشاة ، الملقط ، والمقص الربيع لإزالة الشبكية من الصلبة. يتم ذلك عن طريق فصل الشبكية من الصلبة ومن ثم قطع الصلبة بعيدا مع المقص. لا بد من القيام بهذه العملية في زيادات صغيرة بحيث لا يلحق الضرر أو تمزق نسيج الشبكية. ليست صلبة فصلها بسهولة من العصب البصري حتى بقايا قطع بعناية الصلبة حول العصب البصري.
3. عند هذه النقطة احتفظت بشكلها المنحني شبكية العين ، وتحتاج إلى بالارض لأخذ العينات. قبل تسطيح الشبكية ، يمكن إزالة النكتة الزجاجي الذي يحتوي على اتساق هلام ، في وجود تورم. لشد شبكية العين على شريحة ، وجعل التخفيضات شعاعي عدة بشفرة المشرط. ويمكن الآن للفكاهة الزجاجي المتبقية يمكن إزالتها مع ورقة عادية وتصفية الفرشاة ملف. تتعرض الخلايا الشبكية طبقة العقدة في هذه المرحلة ولذلك فمن الضروري أن يكون لطيف عندما إزالة النكتة الزجاجي. إذا كان لا يزال مربوطا في العصب البصري في القرص البصري ، إزالة العصب البصري دون تمزيق الشبكية باستخدام شفرة مشرط ومقص الربيع. هذا هو الآن في شبكية العين جبل مسطح الشكل (1) والنقرة كما ينبغي أن يكون واضحا رقعة مظلمة في الاتجاه الزماني / بطني من القرص البصري.

الجزء 4 : أخذ العينات

1. هناك عدد من الخيارات لأخذ عينات من شبكية العين. هنا سنقوم بشرح إعداد flatmount isodentric وأخذ العينات. لكل من الإجراءات flatmount الشبكية مع طبقة من الألياف البصرية بعيدا عن الشريحة. إذا كان القصد هو دراسة الخلايا الشبكية طبقة العقدة في إعداد flatmount ، فمن الضروري إزالة أو تبييض ظهارة الصباغية. لإزالة ظهارة الصباغية استخدام الفرشاة برفق لإزالة بعض هذه الطبقة ، وهذا يميل إلى تلف طبقة مستقبلة للضوء. تبيض ينطوي تمرغ في الشبكية في محلول برمنجنات البوتاسيوم (0.25 ٪) لمدة 1 ساعة ، الغسيل في الماء المقطر ، والمقاصة في حمض الأكساليك (5 ٪) لمدة 5 دقائق. ²
2. إذا كان القصد هو دراسة توزيع الخلايا والتشكل من كل طبقة في جميع أنحاء شبكية العين ، ثم نقترح متساوي القياس أخذ العينات من شبكية العين. وينبغي flatmounted شبكية العين على شريحة وأبقى رطبة مع برنامج تلفزيوني. لأخذ العينات متساوي القياس قطع قطعة صغيرة من النسيج على مسافة واحدة من القرص البصري في الاتجاهين ، والأنف الزمنية ، العلوي والسفلي (الشكل 1). ليس من الضروري أن تبييض البشرة المصطبغة في هذا الإعداد. يمكن أن تكون هذه القطع الآن مقطوع في الطائرة الاكليلية مع ناظم البرد ، vibratome ، أو مشراح مستدق اعتمادا على سؤال البحث. لsectioning ناظم البرد ، ينبغي cryoprotected القطع في السكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها ، والمجمدة في سياق المتوسطة المتزايدة على الثلج الجاف. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من العينات في شرائح وأغار على vibratome. سوف ناظم البرد والاستعدادات vibratome العائد موثوق المقاطع ورقيقة ك 4 متر. إذا كانت هناك حاجة أرق المقاطع (على سبيل المثال لإعداد المجهر الإلكتروني) ، فمن الضروري لتحضير العينات لمشراح مستدق. للقيام بذلك ، يجب أن تكون المقاطع بعد إصلاحها في رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 1 ساعة تحت fumehood. ويعقب ذلك من خلال الجفاف في سلسلة متدرجة الايثانول (50 ، 70 ، 95 ، 95 ، 100 ، 100 ٪) و 100 ٪ أكسيد البروبيلين. النسيجثم مضمن في EPON (EMBED - 812 طقم التضمين).

الجزء 5 : نتائج الممثل :

في المختبر لدينا ، نقوم بشكل روتيني المناعية على الشبكية cryosectioned (الشكل 2). في هذه الحالة ونحن مهتمون في isodensity مستقبلات القنب (CB1) في شبكية العين الرئيسيات. كما نقوم بدراسة الآثار المترتبة على التعرض قبل الولادة الايثانول على النظام البصري الرئيسيات. تحقيقا لهذه الغاية ، ونحن مهتمون في كثافة وسماكة طبقة الخلايا في النقرة والمحيطية في الشبكية. لتحقيق هذا الهدف ، علينا ترسيخ قطع الشبكية في EPON ، شريحة في 700nm على مشراح مستدق ، وصمة عار مع الأزرق طولويدين 1 ٪ (الشكل 3).

تستخدم الرقم 1 Flatmount الشبكية. التخفيضات شعاعي لتتسطح في شبكية العين.

الشكل 2 Immunostaining. immunostained Cryosection الشبكية الطرفية لCB1 حيث وصفت بشكل كبير في الخلايا الشبكية العقدة مع بعض العلامات في طبقات النووية الداخلي والخارجي. سمك من هذا القسم هو 14 مترا وملون على الشريحة. RG -- طبقة الشبكية العقدة ؛ IP -- طبقة ضفيري الداخلية ؛ IN -- الطبقة النووية الداخلية ؛ OP -- طبقة ضفيري الخارجي ؛ ON -- طبقة النووية الخارجي.

الشكل 3 النقرة. القسم من خلال النقرة التي كانت جزءا لا يتجزأ من EPON وشرائح على ultramicrotrome في 700nm. تم استخدام طبقة مبصرة (PR) لمحاذاة المقاطع. لاحظ أنه يمكن التعرف على مدى كامل من مبصرات يدل على زاوية مناسبة في الطائرة الاكليلية. وقد أخذت قياسات الكثافة في 300 م ، 500 م ، و 800 متر من وسط الحفرة نقري باستخدام نظام التصوير Bioquant.

RG -- طبقة الشبكية العقدة ؛ IP -- طبقة ضفيري الداخلية ؛ IN -- الطبقة النووية الداخلية ؛ OP -- طبقة ضفيري الخارجي ؛ ON -- طبقة النووية الخارجي ؛ شريط النطاق = 50 م

التحضير لشبكية العين بوصفها wholemount يسمح لتحليل التضاريس والتوزيع المكاني للطبقة إما العقدة الخلية أو الخلايا البطانية في الأوعية الدموية في شبكية العين ^3. ويتم إنجاز بسهولة تقدير حجم الكثافة خلية في محيط الشبكية الرئيسيات. ومع ذلك ، في المناطق perifoveal ونقري ، والتراص من طبقات متعددة في طبقة الخلايا العقدية يعوق الكمي. للتحايل على هذا التحيز المحتملة ، يمكن تشريح النقرة والمنطقة perifoveal من إعداد wholemount ، جزءا لا يتجزأ من EPON ، ومقطوع متسلسل باستخدام مشراح مستدق للحصول على شبه رقيقة المقاطع في الطائرة ^2،4 الاكليلية. هناك عدد من العيوب الأخرى لإعداد wholemount ، والتي يمكن التغلب عليها مع نماذج العينات البديلة.

أخذ عينات من متساوي القياس شبكية العين وsectioning في الطائرة الاكليلية على ناظم البرد إما أو vibratome يسمح للفحص معينة من طبقات مختلفة ، والتي لا يمكن تنفيذها بسهولة على إعداد wholemount. Sectioning بهذه الطريقة يسمح أيضا لتطبيق البروتوكولات immnohistochemistry متعددة ^5. ويمكن بعد هذه المقاطع يمكن إزالتها من الشريحة ، وجزءا لا يتجزأ من شرائح EPON على مشراح مستدق. يمكن مع التغيرات قاصر مشراح مستدق في زاوية القطع التي بذلت لضمان أن تكون طائرة القياسية الاكليلية من خلال المستقبلات الضوئية. بمجرد الحصول على طائرة القياسية ، يمكن قياس سمك طبقة وبالمقارنة بين المناطق الشبكية والعباد. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام جزءا لا يتجزأ من نسيج EPON في دراسات المجهر الإلكتروني للكشف عن الخصائص التركيبية لشبكية العين ^6.