Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe

1. Tissue sollte gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. Es wird empfohlen, dass kurz nach der Tötung der Augen mit Fixiermittel nur unter der Linse gespritzt werden und in Fixativ.
2. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten.

Teil 2: Entfernung des Augapfels aus der Augenhöhle

1. Für einen leichteren Zugang zu den Augapfel ist es empfehlenswert, entfernen Sie zunächst das Gehirn. Sobald das Gehirn entfernt wurde das dünnwandige Umlaufbahn Knochen ist leicht ersichtlich. Verwenden Sie die Knochen Rongeure langsam Chip entfernt die Wand der Augenhöhle. Schneiden Sie die Augenmuskeln mit einem Skalpell entfernen und das Bindegewebe aus dem Augapfel. Schneiden Sie vorsichtig den Sehnerv, kann diese in elektronischer Mikroskopie Studien verwendet werden. Der Augapfel wird jetzt aus der Augenhöhle freigegeben werden.

Teil 3: Präparieren der Netzhaut von der Augenmuschel

1. Legen Sie das Auge in eine Petrischale mit PBS auf die Netzhaut vor dem Austrocknen bewahren. Ein Binokular oder Tisch montiert Vergrößerungslampe Stand befindet sich in der Sektion nützlich, aber nicht eine Notwendigkeit. Entfernen der Hornhaut, indem die Lederhaut in engem Zusammenhang mit dem Umfang der Hornhaut auf der Ebene der Ora serrata mit einem Paar Frühling Schere und entfernen Sie das Objektiv mit der Zange.
2. Verwenden Sie einen Pinsel, Pinzette, Schere und Feder auf der Netzhaut von der Lederhaut zu entfernen. Dies ist durch die Trennung der Netzhaut von der Lederhaut und dann schneiden die Lederhaut weg mit der Schere gemacht. Man muss diesen Prozess auszuführen in kleinen Schritten, um nicht zu beschädigen oder zu reißen Netzhautgewebe. Die Sklera ist nicht ohne weiteres aus dem Rest des Sehnervs getrennt, so sorgfältig geschnitten der Lederhaut um den Sehnerv.
3. An diesem Punkt der Netzhaut hat ihre gebogene Form erhalten und muss für die Probenahme abgeflacht werden. Vor Abflachung der Netzhaut kann der Glaskörper, der die Konsistenz von Gelee hat, in einem Klumpen zu entfernen. Zum Reduzieren der Netzhaut auf eine Folie, um mehrere radiale Schnitte mit einem Skalpell. Die restlichen Glaskörper können nun mit gewöhnlichen Filterpapier und einem Pinsel entfernt werden. Die retinalen Ganglienzellen ist an dieser Stelle ausgesetzt so ist es unerlässlich, sanft zu sein, wenn das Entfernen des Glaskörpers ist. Wenn der Sehnerv ist noch in der Papille angebracht sind, entfernen den Sehnerv ohne zu reißen der Netzhaut mit einem Skalpell und ein Paar Frühling Schere. Dies ist nun eine flache Montage Netzhaut (Abbildung 1) und der Fovea sollte so ein dunkler Fleck in der zeitlichen / ventral von der Papille sichtbar.

Teil 4: Probenahme

1. Es gibt eine Reihe von Optionen zum Abtasten der Netzhaut. Hier beschreiben wir die Flatmount Vorbereitung und isodentric Probenahme. Für beide Verfahren Flatmount der Netzhaut mit den Glasfaser-Schicht von der Folie. Wenn die Absicht besteht, den retinalen Ganglienzellen in der Flatmount Vorbereitung zu untersuchen, ist es notwendig, entweder zu entfernen oder Bleichmittel das Pigmentepithel. So entfernen Sie das Pigmentepithel mit einem Pinsel leicht, einen Teil dieser Schicht zu entfernen, führt dies tendenziell zu den Photorezeptorschicht Schäden. Bleaching beinhaltet Einweichen der Netzhaut in Kaliumpermanganatlösung (0,25%) für 1 Stunde, Waschen in destilliertem Wasser, und das Clearing in Oxalsäure (5%) für 5 Minuten. ²
2. Wenn die Absicht besteht, Zell-und Morphologie der einzelnen Schichten über die Netzhaut zu untersuchen, dann empfehlen wir isometrische Abtastung der Netzhaut. Die Netzhaut sollten auf einer Folie flatmounted und feucht gehalten mit PBS. Für isometrische Probenahme schneiden kleine Stücke von Gewebe gleich weit entfernt von der Papille in der Nase, zeitliche, oberen und unteren Richtungen (Abbildung 1). Es ist nicht notwendig zu bleichen das Pigmentepithel in dieser Zubereitung. Diese Stücke können jetzt in der koronalen Ebene geschnitten mit einem Kryostaten, Vibratom oder Ultramikrotom je nach Fragestellung. Für Kryostat Schnitte, sollten die Stücke in 30% Saccharose Nacht cryoprotected und eingefroren in Zusammenhang mit einem Eindeckmedium auf Trockeneis. Alternativ können die Proben in Agar eingebettet werden und in Scheiben geschnitten auf einem Vibratom. Der Kryostat und Vibratom Präparate zuverlässig Ertrag Abschnitte so dünn wie 4 m. Wenn dünner Schnitte erforderlich sind (z. B. für Elektronenmikroskop Vorbereitung), ist es notwendig, die Proben für die Ultramikrotom vorzubereiten. Um dies zu tun, sollten die Abschnitte werden post-fixed in Osmiumtetroxid für 1 Stunde unter dem Abzug durchzuführen. Dies wird durch Dehydrierung in einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 70, 95, 95, 100, 100%) und 100% Propylenoxid gefolgt. Das Gewebewird dann in Epon (Embed-812 Einbettung Kit) eingebettet.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:

In unserem Labor haben wir routinemäßig Immunhistochemie auf kryogeschnitten retinae (Abb. 2). In diesem Fall sind wir in der isodensity von Cannabinoid-Rezeptoren (CB1) in der Netzhaut von Primaten interessieren. Wir untersuchen auch die Auswirkungen der pränatalen Ethanol-Exposition auf die Primaten visuellen Systems. Zu diesem Zweck sind wir daran interessiert, Zelldichte und Schichtdicke in der Fovea und in der peripheren Netzhaut. Um dies zu erreichen, betten wir Stücke von Netzhaut in Epon, Slice bei 700nm auf einem Ultramikrotom und Fleck mit 1% Toluidinblau (Abbildung 3).

Abbildung 1 Flatmount Retina. Radial Schnitte werden verwendet, um die Netzhaut zu glätten.

Abbildung 2 Immunfärbung. Gefrier der peripheren Netzhaut immungefärbt für CB1, wo die retinalen Ganglienzellen stark mit einigen Kennzeichnung in der inneren und äußeren nuklearen Schichten gekennzeichnet sind. Die Dicke dieser Abschnitt ist 14 m und gefärbt auf der Folie. RG - retinalen Ganglienzellen Schicht; IP - inneren plexiformen Schicht; IN - innere Körnerschicht; OP - plexiformen Schicht; ON - äußere Körnerschicht.

Abbildung 3 Fovea. Schnitt durch die Fovea, die in Epon eingebettet war und in Scheiben geschnitten auf einem ultramicrotrome bei 700nm. Die Photorezeptorschicht (PR) wurde verwendet, um die Abschnitte auszurichten. Beachten Sie, dass das gesamte Ausmaß der Photorezeptoren identifiziert werden können zeigt einen geeigneten Winkel in der Frontalebene werden. Dichte-Messungen wurden bei 300 m, 500 m und 800 m vom Zentrum der Fovea Grube mit dem Bioquant Imaging-System übernommen.

RG - retinalen Ganglienzellen Schicht; IP - inneren plexiformen Schicht; IN - innere Körnerschicht; OP - plexiformen Schicht; ON - äußere Körnerschicht; Balken = 50 m

Die Vorbereitung der Netzhaut als wholemount ermöglicht die Analyse der Topographie und räumliche Verteilung der entweder die Ganglienzellschicht oder den Endothelzellen der retinalen Gefäße ^3. Die Quantifizierung der Zelldichte in der Peripherie der Netzhaut von Primaten ist leicht erreicht. jedoch in perifovealen und fovealen Regionen, behindert das Stapeln mehrerer Schichten in den Ganglienzellen Quantifizierung. Um dies zu umgehen potenzielle Verzerrung kann der Fovea und perifovealen Region aus der wholemount Vorbereitung seziert werden, eingebettet in Epon und seriell geschnitten mit einem Ultramikrotom zu Semidünnschnitten in der Frontalebene ^2,4 erhalten. Es gibt eine Reihe weiterer Nachteile, die wholemount Vorbereitung, die mit alternativen Probenahme Paradigmen überwunden werden können.

Unter isometrischen Proben aus der Netzhaut und Schneiden in der koronalen Ebene entweder auf einem Kryostaten oder Vibratom ermöglicht spezifische Untersuchung der verschiedenen Schichten, die nicht ohne weiteres auf einem wholemount Vorbereitung durchgeführt werden können. Schnitte auf diese Weise ermöglicht auch die Anwendung von mehreren immnohistochemistry Protokolle ^5. Diese Abschnitte können dann von der Folie entfernt werden, eingebettet in Epon und in Scheiben geschnitten auf einem Ultramikrotom. Mit einem Ultramikrotom geringfügige Änderungen in der Schnittwinkel gemacht, um ein Standard-koronalen Ebene durch die Photorezeptoren zu gewährleisten. Nach einer Standard-Flugzeug erhalten worden ist, kann Schichtdicke gemessen und verglichen werden zwischen Netzhaut Regionen und Themen. Darüber hinaus können Epon eingebetteten Gewebe in elektronenmikroskopischen Studien verwendet werden, um ultrastrukturelle Eigenschaften der Retina ⁶ zeigen.