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Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain. J. Vis. Exp. (27), e1262, doi:10.3791/1262 (2009).
गैर मानव प्राइमेट मानव मस्तिष्क की सामान्य कार्य और रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण translational प्रजातियों है. निष्पक्ष stereology, ऊतक वर्गों में जैविक वस्तुओं की मात्रा का ठहराव के लिए राज्य के-the-कला के रूप में स्वीकार किए जाते हैं विधि
भाग 1: पूर्व ऊतक के प्रसंस्करण बर्क एट अल अनुसार किया जाना चाहिए. (2009) 5.
संक्षेप में, ऊतक में अच्छी तरह से paraformaldehyde, glutaraldehyde, या formalin के साथ perfused होना चाहिए. यह मानक transcardial आमतौर पर अन्य अंगों की फसल के लिए इस्तेमाल किया छिड़काव के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. वर्तमान अध्ययन में विषय ketamine (10 मिग्रा / किग्रा, IM) हाइड्रोक्लोराइड, सोडियम pentobarbital (iv 25 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ अति euthanized के साथ गहराई से बेहोश किया गया था और 0.1 एम पीबीएस साथ transcardially perfused जब तक पूरी तरह से exsanguinated. यह पीबीएस में 5 मिनट (~ 1 लीटर) के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान द्वारा पीछा किया जाता है. टिश्यू अच्छी तरह से paraformaldeyhde, gluteraldehyde, या formalin के साथ perfused होना चाहिए. मस्तिष्क stereotaxically अवरुद्ध चाहिए खोपड़ी से हटा दिया, वजन, निर्धारित मात्रा, cryoprotected, और 5 जमी.
भाग 2: ऊतक के व्यवस्थित नमूनाकरण बर्क एट अल के अनुसार,. (2009) 6.
इस उदाहरण में हम vervet मस्तिष्क के ललाट लोब पर ध्यान केंद्रित किया. संदर्भ अंतरिक्ष करने के लिए केंद्रीय परिखा से बाएँ गोलार्द्ध के ललाट पोल cortical ऊतक शामिल परिभाषित किया गया था. हमारे प्रयोजनों के लिए श्रृंखला प्रांतस्था भर में 1 / 10 वर्गों, 50μm में sectioned पर सेट किया गया. एक पूरी श्रृंखला cresyl वायलेट श्रृंखला (# 1) के साथ दाग था. श्रृंखला 2 तो वर्गों की है कि आधे माइलिन रहस्योद्घाटन और acetylcholine esterase के लिए दूसरे आधे दाग (कुछ subcortical क्षेत्रों के चित्रण के लिए) के लिए सोने के क्लोराइड के साथ दाग थे विभाजित किया गया था. अन्य सभी श्रृंखला में हमारी लंबी अवधि के अनुसंधान की योजना के भाग के रूप में प्रतिजन बनाए रखने के बैंकिंग थे.
भाग 3: Stereology (अधिक जानकारी के लिए, 2002 Mouton) 4
सेल नंबर के कुल अनुमान (एन) निम्न समीकरण के आधार पर गणना की है : एन = SSF -1 एक्स asf -1 x TSF -1 एक्स Σ क्यू - कहाँ SSF अनुभाग नमूना अंश है, asf क्षेत्र नमूना अंश, TSF है यदि मोटाई नमूना अंश (जहां ऊतक की मोटाई मापा चीड़फाड़ करनेवाला ऊंचाई से विभाजित है), और Σ क्यू - गिना ब्याज की वस्तुओं की कुल संख्या है चीड़फाड़ करनेवाला भीतर. इस प्रोटोकॉल के अगले अनुभागों को दिखाने के लिए कैसे निर्धारित करने के लिए SSF, asf, TSF और Σ क्यू.
धारा नमूनाकरण भिन्न (गैर कंप्यूटर आधारित)
संपूर्ण संदर्भ अंतरिक्ष अच्छी तरह से उदर पीछे करने के लिए पूर्वकाल और पृष्ठीय से परिभाषित होना चाहिए. इस उदाहरण में हम ललाट लोब में रुचि रखते थे और यह ललाट पोल (पूर्वकाल) की नोक से केंद्रीय परिखा (पोस्टीरियर) और पार्श्व परिखा (उदर) के क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया और insula अपवर्जित.
इस विषय विशेष के ललाट पालि के लिए कुल 760 वर्गों के व्यवस्थित cresyl वायलेट के लिए 76 दाग के साथ एकत्र किए गए थे. चूंकि लक्ष्य संदर्भ अंतरिक्ष भर में 10 वर्गों था 1 / 6 cresyl बैंगनी दाग वर्गों नमूना थे, के बारे में 1 / 60 की एक धारा नमूना भिन्न करने के लिए अग्रणी. हम बेतरतीब ढंग से पहले 6 cresyl बैंगनी दाग वर्गों के साथ शुरू किया और व्यवस्थित 6 / 1 उसके बाद नमूना है. कुल 13 वर्गों के एक चयनित विषय (चित्रा 2) के लिए नमूना थे.
क्षेत्र नमूना भिन्न (कंप्यूटर आधारित)
एक पायलट अध्ययन इष्टतम ग्रिड आकार, क्षेत्र नमूनाकरण भिन्न संकेत मिलता है, के बारे में 100-300 disectors के साथ संदर्भ अंतरिक्ष नमूना होगा. ललाट पालि के भीतर, २५०० दो सुक्ष्ममापी की एक ग्रिड आकार इस विषय के लिए 254 disectors (चित्रा 2) के एक औसत झुकेंगे. disector के आकार के बारे में 0-5 इस मामले में गिना वस्तुओं, न्यूरॉन्स के बीच उपज चाहिए.
मोटाई नमूना भिन्न (कंप्यूटर आधारित)
प्रत्येक disector स्थान पर, ऊतक की ऊंचाई को मापा है, और इस ऊंचाई के एक अंश नमूना है, इस मोटाई नमूनाकरण भिन्न रूप में जाना जाता है. मापा मोटाई का निर्धारण करने के लिए, z विमान के माध्यम से ध्यान केंद्रित पहले कक्ष तक ध्यान में आता है, तो वापस अनुभाग में, यानी की शीर्ष करने के लिए थोड़ा ऊपर है, जब तक अंतिम वस्तु सिर्फ ध्यान से बाहर दिखाई देता है. ऊतक के नीचे निर्धारित करने के लिए, z विमान के माध्यम से ध्यान केंद्रित जब तक कोशिकाओं को ध्यान से बाहर मुश्किल कर रहे हैं.
Z विमान के माध्यम से ध्यान केंद्रित, कोशिकाओं हर गहराई में दाग होना चाहिए, अगर नहीं, इस ऊतक के दाग या गैर वर्दी निर्जलीकरण के एक अधूरी पैठ संकेत मिलता है, जो मामले में वर्गों फिर दाग चाहिए. इस एहतियात immunostained ऊतक कि अपेक्षाकृत मोटी ऊतक वर्गों के माध्यम से immunoprobes के प्रवेश की आवश्यकता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस कारण के लिए, immunostained ऊतक हल्के basophilic दाग (जैसे, cresyl बैंगनी, हेमा के साथ counterstained होना चाहिए) toxylin क्रम में सही और अनुभाग के ऊपर और नीचे निर्धारित करने के लिए और एंटीबॉडी के प्रवेश की पुष्टि. इस अध्ययन में वर्गों 50μm की एक सूक्ष्म तक्षणी सेटिंग में कटा हुआ थे. सभी ऊतक प्रसंस्करण के बाद पूरा हो गया है, ऊतक मोटाई मापा 17.9μm (चित्रा 2) के बारे में 65% का एक मतलब संकोचन के साथ, औसत. नोट है कि इन परिणामों दिनचर्या histological 7 तैयारी के लिए प्रसंस्कृत ऊतक के लिए ठेठ संकोचन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
विशिष्ट अध्ययन के लिए डिफ़ॉल्ट disector ऊंचाई 10μm है. disector ऊंचाई और मापा अनुभाग मोटाई के बीच अंतर गार्ड ऊंचाई, जहाँ कोई जैविक सुविधाओं को गिना जाता है ऊतक की मात्रा है. गार्ड की ऊंचाई उपयोग सेक्शनिंग सतहों पर ऊतकों को नुकसान से बचा जाता है (जैसे, खो टोपियां).
वस्तुओं की कुल संख्या को गिना, Σ क्यू -
मान्यता त्रुटियों से पूर्वाग्रह से बचने के लिए, यह जरूरी है कि एक मानक परिभाषा ब्याज की विशेष रूप से जैविक विशेषता के लिए पीछा किया जाता है. इस मामले में, हम न्यूरॉन्स की गिनती करने में रुचि रखते थे. इसलिए, एक न्यूरॉन एक दृश्य केन्द्र स्थित nucleolus और एक स्पष्ट रूप से परिभाषित cytoplasm रहा है, जबकि glial कोशिकाओं आम तौर पर दिखाई nucleoli और cytoplasm अभाव के रूप में परिभाषित किया गया था. के लिए इस विषय 457 न्यूरॉन्स गिना रहे थे.
भाग 4: Stereologer - एक कम्प्यूटरीकृत Stereology प्रणाली (Stereology संसाधन केंद्र, चेस्टर, एमडी)
Stereologer सिस्टम उपयोगकर्ता एक कदम दर कदम फैशन में आवश्यक जानकारी भरने के लिए संकेत देता है. "अध्ययन जानकारी" खंड में अध्ययन के मापदंडों को स्थापित कर रहे हैं. के बाद से एक संदर्भ अंतरिक्ष अध्ययन के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए, मात्रा पैरामीटर (Cavalieri अनुमानक संदर्भ अंतरिक्ष के लिए चयनित किया जाना चाहिए) चयनित किया जाना चाहिए. वस्तु की मात्रा भी यहाँ चुना जा सकता है के लिए ब्याज की वस्तुओं की आबादी के लिए संख्या भारित मात्रा का अनुमान है. हमारे उदाहरण के लिए, केवल संदर्भ अंतरिक्ष की मात्रा का चयन किया गया था. प्रत्येक वस्तु के लिए, संख्या का चयन करें और इस मामले में न्यूरॉन्स में ब्याज की सुविधा को परिभाषित.
प्रकरण प्रारंभ: इस खंड में नमूना जानकारी स्थापित है. स्लैब नमूने अंतराल दर्ज करें (अगर ऊतक के अलग - अलग स्लैब exhaustively कटा रहे थे और प्रत्येक अनुभाग अनुक्रमिक क्रम में रखा जाता है तो एक यहाँ दर्ज करें). संदर्भ अंतरिक्ष (760 मामले में) के माध्यम से लिया वर्गों की कुल संख्या दर्ज करें. तब अनुभाग नमूना अंतराल (इस मामले में 59) दर्ज करें. व्यवस्था तो (इस मामले में 13) जांचा जा वर्गों की संख्या की गणना.
जांच पैरामीटर: यह खंड ग्रिड और disector आकार को परिभाषित करता है. मात्रा के लिए, एक कम बढ़ाई 2.5x 10x का उपयोग करने के लिए संपादित करें मेनू के तहत ग्रिड अंतरालन परिभाषित. ऑब्जेक्ट बढ़ाई 100x (एनए 1.3 या 1.4) में किया जाना चाहिए. फ़्रेम क्षेत्र disector के आकार है, इस मामले में हम 50% स्क्रीन का इस्तेमाल किया. फ्रेम ऊंचाई disector की मोटाई है, यहाँ 10μm पर सेट है. फ्रेम रिक्ति ग्रिड के आकार है. हम हमारे पायलट अध्ययन में पाया कि 2500μm पैदावार 150-200 फ्रेम के बीच एक अपेक्षाकृत बड़े संदर्भ अंतरिक्ष के माध्यम से एक तरह से व्यवस्थित वर्दी में दूरी है. छोटे क्षेत्रों के लिए, एक छोटे ग्रिड आकार किया जाना चाहिए. एक पायलट अध्ययन प्रत्येक विशेष रूप से अध्ययन के लिए ऑप्टिकल जांच मापदंडों की पहचान करेगा.
एक बार अध्ययन मापदंडों स्थापित किया गया है, ऊतक के माध्यम से नमूना आगे बढ़ सकते हैं. प्रोग्राम आपको पहले अनुभाग नमूना चरण 1 prompt जाएगा. प्रोग्राम उपयोगकर्ता prompt कम आवर्धन के तहत, अनुभाग पर संदर्भ अंतरिक्ष ट्रेस. प्रणाली तो जांच पैरामीटर और उपयोगकर्ता के आधार पर अनुभाग पर एक ग्रिड जगह होगी तब सत्यापित करें कि अंक संदर्भ अंतरिक्ष के भीतर गिर जाएगी. यदि एक बिंदु संदर्भ अंतरिक्ष के भीतर नहीं है बस बिंदु पर क्लिक करें और मात्रा में नहीं होगा गणना चरण 2: संदर्भ अंतरिक्ष प्रणाली से अधिक फ्रेम रिक्ति मापदंडों पर आधारित एक नया ग्रिड, जगह होगी. . सत्यापित करें कि चौराहों संदर्भ अंतरिक्ष के भीतर चरण 3 गिरावट: प्रणाली तो उपयोगकर्ता उच्च बढ़ाई उद्देश्य के लिए स्विच करने के लिए संकेत देगा और पहली चीड़फाड़ करनेवाला मंच को स्थानांतरित चरण 4: इस बिंदु पर सिस्टम उपयोगकर्ता को परिभाषित करने के लिए संकेत देता है अनुभाग के ऊपर और नीचे तो सिस्टम z-अक्ष चरण 5 में नमूने अंतरिक्ष सेट: उपयोगकर्ता तो प्रत्येक वस्तु है कि z विमान के माध्यम से disector के भीतर गिर पर क्लिक करेंगे. वस्तुओं है कि लाल लाइनों या disector के नीचे छू नहीं गिना जा सकता है. एक बार प्रत्येक वस्तु में गिना जाता है, अगला क्लिक करें. चरण अगले disector और कदम 4 और 5 दोहराया जाएगा करने के लिए कदम होगा. एक बार अनुभाग के लिए disectors के सभी गिना गया है, सिस्टम उपयोगकर्ता prompt अगले अनुक्रमिक अनुभाग सम्मिलित करने के लिए जांच होनी है. 1-5 कदम तक अनुक्रमिक वर्गों के सभी है दोहराया जाएगागया नमूना. व्यवस्था तो asf, SSF, TSF, और Σ क्यू के लिए गणना प्रदान करेगा . इन मानकों के आधार पर, सिस्टम एक अनुमान के अनुसार एन उत्पन्न, संदर्भ मात्रा जाएगा और CE दोनों अनुमानित संख्या और मात्रा के लिए. यह भी सिफारिशें दे करने के लिए और अधिक कुशल बनने या CE (चित्रा 2) कम.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:
निष्पक्ष stereology एक संदर्भ अंतरिक्ष के भीतर सेल आबादी के कुशल और विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है. कंप्यूटर आधारित stereological उपलब्ध सिस्टम है, जो सभी के व्यवस्थित नमूने और एक परिभाषित संदर्भ स्थान पर निर्भर के एक नंबर रहे हैं. हम BioQuant जीवन विज्ञान प्रणाली का इस्तेमाल किया है के लिए दो वर्षीय vervets के मस्तिष्क प्रांतस्था के कुल neuronal जनसंख्या का आकलन करने के लिए .042 के एक औसत CE (चित्रा 3) के साथ 828 लाखों खत्म हो. हम बाद में Stereologer सिस्टम का इस्तेमाल करने के लिए अनुमान के बारे में आधा cortical न्यूरॉन्स की संख्या 8 के लिए ललाट पालि खातों कि.
चित्रा 1 कंप्यूटर आधारित Stereology सिस्टम. Stereology सिस्टम के बुनियादी सेट अप एक ही है, एक motorized मंच (xyz) के साथ एक माइक्रोस्कोप, एक मंच नियंत्रक, वीडियो कैमरा, कंप्यूटर, और सॉफ्टवेयर है . प्रणाली है कि अंततः चुना है दक्षता, की जरूरत है, और लागत विश्लेषण पर आधारित होना चाहिए.
अध्ययन जानकारी
अध्ययन का नाम
ललाट प्रांतस्था
प्रधान अन्वेषक
एमबी
प्रजाति
एजी
संदर्भ अंतरिक्ष ललाट
प्रांतस्था
नोट्स
मामला जानकारी
डेटा कलेक्टर
एमबी
तिथि
बुधवार, 30 अप्रैल, 2008
समूह
नियंत्रण
विषय
O26
नोट्स
नमूने खासियत
स्लैब नमूनाकरण अंतराल
1
कुल अनुभागों की संख्या
760
अनुभाग नमूनाकरण अंतराल
59
शुरू धारा
2
Fractions
ASF
0.०००२
SlabSF
1.0000
SSF
0.०१६९
TSF
.5587
परिणामों के लिए सारांश
पैरामीटर
जांच
नाम
परिणाम
CE
एसडी
मोटाई
---
---
17.8996 μ
---
---
संख्या
Disector
न्यूरॉन
243833769.1473
०.०,४७४
N / A
आयतन
Cavalieri प्वाइंट ग्रिड
आयतन
1719769397954.1284 ^ 3 μ
०.०,०७८
N / A
सिफारिशें
जांच
ऑब्जेक्ट संख्या (न्यूरॉन)
CE
०.०,४७४
अनुशंसाएँ
CE स्वीकार्य है.
देखा Disectors की संख्या बहुत अधिक है, Disector रिक्ति बढ़ाएँ.
जांच
क्षेत्र वॉल्यूम (मात्रा)
CE
०.०,०७८
अनुशंसाएँ
CE स्वीकार्य है.
खंड परिणामों
अनुभाग
न्यूरॉन न्यूरॉन NumCorners NumObjects
मात्रा RegPoints
1. 40
48
34
2. 26
52
44
3. 29
56
48
4. 39
100
83
5. 49
112
83
6. 53
156
120
7. 65
128
106
8. 45
108
100
9. 52
100
77
10. 26
64
60
11. 21
44
44
12. 11
36
32
13. 1
12
6
Fontal Stereologer सिस्टम के साथ प्राप्त पालि से 2 परिणाम चित्रा ललाट पालि के लिए, stereological प्रक्रिया के लंबे समय तक हिस्सा व्यवस्थित नमूने और सेक्शनिंग में किया गया था .. स्थलाकृति मात्रा, और neuronal अनुमान के बारे में प्रत्येक विषय के लिए एक दिन में पूरा किया गया. बाएँ गोलार्द्ध नमूना था और संख्या दोनों गोलार्द्धों के लिए लगभग एक अनुमान के पाठ में दोगुनी है.
चित्रा 3 प्रांतस्था Neuronal जनसंख्या अनुमान BioQuant के साथ प्राप्त BioQuant प्रणाली सेल गिनती से पहले एक सटीक स्थलाकृति की आवश्यकता है. यहाँ 13 वर्गों के एक औसत नमूना थे. Cortical स्थलाकृति और बाद मात्रा आकलन के प्रत्येक विषय के लिए 15-20 घंटे के बीच ले लिया. स्थलाकृति एक 2.5x उद्देश्य के तहत प्रदर्शन किया गया था और गिनती एक 100x तेल विसर्जन उद्देश्य (1.3 एनए) का उपयोग किया गया था. हर 100 180 नमूना disectors के एक औसत के साथ बाएँ गोलार्द्ध अनुभाग भर में चुना गया था. एक बार स्थलाकृति पूरा किया गया neuronal गिनती एक दिन के बारे में ले लिया. बाएँ गोलार्द्ध नमूना था और संख्या दोनों गोलार्द्धों के लिए लगभग एक अनुमान के पाठ में दोगुनी है.
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एक रहनुमा मस्तिष्क में निष्पक्ष stereology अन्य जैविक नमूनों के समान है. हालांकि, रहनुमा मस्तिष्क के आकार को देखते हुए, एक सावधान प्रसंस्करण की योजना के बाद से vervet बंदर की एक एकल गोलार्द्ध में 1200 से अधिक वर्गों पैदावार जब 50μm में कटा हुआ सिफारिश की है. पहले हम stereotaxically 1cm ब्लॉक, जो ब्लॉक और विषयों के बीच खंड के एक मानक विमान प्रदान करता है, ब्लॉक के बीच आंशिक वर्गों के कम से कम, और प्रबंधनीय आकार 5 ब्लॉक प्रदान करता है में मस्तिष्क अवरुद्ध सलाह देते हैं. Stereology के लिए एक महत्वपूर्ण कदम व्यवस्थित ऐसी है कि 6-10 वर्गों संदर्भ क्षेत्र के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं नमूना है. रहनुमा मस्तिष्क के लिए, इस unprocessed सामग्री का एक महत्वपूर्ण राशि पत्ते, तो क्रम में करने के लिए संभावित प्रत्येक मस्तिष्क से प्राप्त आंकड़ों हम प्रतिजन में ऊतक बैंकिंग सुझाव है कि लंबी अवधि के अनुसंधान की योजना 6 के लिए संरक्षित को अधिकतम. जब ऊतक बैंकिंग है, बंदर दिमाग में लक्ष्य प्रोटीन की पहचान के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण immunodetection stereology 9 के लिए तैयार किया जा सकता है है. प्रांतस्था या lobes जैसे बड़े क्षेत्रों में 10-14 वर्गों की आवश्यकता होती है, इतनी पहले सेक्शनिंग करने के लिए एक योजना के लिए संभावित ब्याज की छोटी संदर्भ अंतरिक्ष के माध्यम से कम से कम 10 वर्गों है बनाया जाना चाहिए सकता है. एक पायलट अध्ययन में यह भी एक नियंत्रण विषय पर किया जाना चाहिए करने के लिए stereological अध्ययन के लिए मानकों सेट. इसके अलावा जब पेश या प्रकाशित stereological डेटा की व्याख्या asf, TSF, SSF, और Σ क्यू उपयुक्त CE मूल्यों के साथ साथ रिपोर्ट चाहिए .
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West, M., Slomianka, L., & Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec 231, 482-497, (1991).
Saper, C.B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol 364, 5 (1996).
Sterio, D.C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc 134, 127-36 (1984).
Mouton, P.R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. The Johns Hopkins University Press Baltimore, (2002).
Burke, M.W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp (2009) accepted.
Burke, M.W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp (2009) accepted.
Burke, M.W., Palmour, R.M., Ervin, F.R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport 20, 13-7 (2009).
Zangenehpour, S., Burke, M.W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp (2009) accepted.
Hi there,
If i understood correctly, you quantified the number of neurons in the frontal cortex of the verbet monkey and you got 243 million neurons in a volume of 1720 mm^3. That renders a density of 142000 neurons / mm^3. Is not that way too much? higher than mice....
If i understood correctly, you quantified the number of neurons in the frontal cortex of the verbet monkey and you got 243 million neurons in a volume of 1720 mm^3. That renders a density of 142000 neurons / mm^3. Is not that way too much? higher than mice....
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ReplyPosted by: Jon ArellanoApril 24, 2011, 7:26 PM