gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.

1. 자료

1. HEPES 버퍼 : 10 MM HEPES - NaOH 산도 7.4, 150 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl _2, 1.8 MM CaCl ₂₎
2. Collagenase D 솔루션 : Collagenase D : 100 MG / ML (Collagenase D> 0.15 U / MG) HEPES에서 버퍼
3. DNase I 솔루션 : 20,000 U / ML DNase I
4. 산도 7.2에서 PBS 버퍼
5. PEB 버퍼 : 20 부품 1 부품 BSA 주식 솔루션 Rinsing 솔루션 autoMACS
6. 조직 : 인접한 장기 무료 7분의 6 week 오래된 성인 여성 BALB / C 마우스에서 파생된 폐.
7. 옵션 : CD11c MicroBeads, 맥 MS 열, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포의 격리 Mac 용 세퍼레이터

2. 폐 조직을 Dissociating

1. 적혈구를 제거하는 PBS가 포함된 배양 접시에있는 조직을 씻어.
2. 4.9 ML의 HEPES 버퍼를 포함하는 gentleMACS C 튜브 450 MG의 폐 조직의 최대 전송합니다.
3. 2 MG / ML Collagenase D.의 최종 농도 100 μL Collagenase D 솔루션 추가
4. 150 MG 조직 (40 U / ML DNase I의 최종 농도) 또는 150-450 MG의 폐 조직을 20 μL DNase I (80 U / ML DNase I의 최종 농도)에 10 μL DNase I 솔루션을 추가합니다.
5. 단단히 C 튜브를 닫고 gentleMACS의 Dissociator에 그것을 연결합니다. 그런 다음 프로그램 "m_lung_01"를 실행합니다.
6. 37 30 분 품어 ° C 자동 또는 수동으로 회전마다 5 분 터닝과 함께.
7. gentleMACS의 Dissociator에 샘플을 반환하고 프로그램 "m_lung_02"를 실행합니다.

3. 여과법

1. 70 μm의 메쉬 셀 스트레이너와 뚜껑을 교체하여 필터링 세포를 수집하기 위해 50 ML 튜브를 준비합니다.
2. 일단 두 번째 gentleMACS 프로그램이 튜브의 샘플 자료의 배포에 따라 종료, 당신은 튜브 하단의 샘플 자료를 수집하기 위해 간단히 튜브를 원심 수 있습니다.
3. 적당한 1,000 μl 피펫 팁을 사용하여 C 튜브의 심장 봉인 캡을 통해 세포를 제거하고 세포 스트레이너에게 적용됩니다.
4. RT에서 5 ML HEPES 버퍼와 셀 스트레이너 씻으십시오.
5. 10 분 300xg에서 50 ML 튜브의 펠렛에 세포를 원심 분리기.
6. 뜨는을 기음과 PEB 버퍼의 원하는 볼륨의 세포 펠렛을 resuspend.

4 부 : 대표 결과 :

그림 1. gentleMACS ™ Dissociator과 폐 분리가 92% 가능한 세포의 결과. 죽은 세포는 찬란 propidium 요오드화물의 (PI) (; 없음 PI의 얼룩 왼쪽 도트 플롯 바로 도트 플롯)와 스테인드되었습니다.

그림 2. 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율의 gentleMACS의 Dissociator 결과를 사용하여 마우스 폐 조직의 해리. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 유동세포계측법에 의해 분석되었다.

그림 3. 마우스 폐 조직에서 파생된 단일 셀 정지 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 마우스 CD11c ^낮은 M - PDCA - 1 + plasmacytoid의 DC가뿐만 아니라 CD11c ^높은 세포를 감지하는 물들일했다.

그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS 구분 기호와 두 MS 열을 사용하여 돌기 세포의 농축.

이 비디오에서는, 우리는 마우스 폐 조직의 분리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 저희는 폐 조직의 기계적 효소 치료의 조합이 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율을 알아낼 것을 보여줍니다. 특히, 조직의 기계적 붕괴는 gentleMACS의 Dissociator에 의해 달성되었다. 고정자 시스템, 부드러운 방식으로 dissociates 조직 - gentleMACS C 튜브는 로터가 포함되어 있습니다. 절차는 악기의 프로그램 설정에 의해 제어됩니다. 설정은 세포의 높은 수율과 생존을 달성하기 위해 최적화되었다. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 leukocytes과 내피 세포를 감지하는 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 단일 세포 현탁액에서 돌기 세포는 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 물들일되었습니다. 또한, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포는 맥 기술을 사용하여 풍부하게되었습니다. 돌기 세포는 자기 (磁气) CD11c MicroBeads를 사용하여 분류하고 MiniMACS 구분 기호와 MS 열을 사용하여 분리되었다 일반적으로 ^1,2와 새로운 분리 프로토콜의 결합 자기 셀 정렬은 폐 조직의 특정 세포 유형을 얻을 수있는 표준 방법을 나타냅니다.

Miltenyi Biotec 저자 GmbH를, 독일의 직원입니다.

1. Swanson, K., et al. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173 : 4875 - 4881 (2004).
2. Vermaelen, K., and Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A 61A : 170 - 177 (2004).

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