Immunocoloration lots pour la détection de protéines à grande échelle dans le cerveau du singe entier

Immunohistochimie est l'une des techniques les plus utilisées pour la caractérisation de l'expression des protéines dans le cerveau de différents modèles animaux expérimentaux. Il est relativement facile à mener systématiquement des procédures immunohistochimiques sur le cerveau des rongeurs et autres communes des modèles expérimentaux avec la taille du cerveau similaires. Cependant, il n'ya pas de travaux publiés, à notre connaissance qui fournit un compte rendu exhaustif de la façon de mener les procédures immunodétection tels travers un cerveau de singe entier. Ce qui suit est une description détaillée de la façon de préparer un cerveau de singe toute à grande échelle détection immunohistochimique des protéines cibles. Ce travail est apparu comme un résultat de la collaboration entre les activités commerciales et académiques. En tant que tel, les détails se rapportant aux tissus enrobage et de sectionnement rester un savoir-faire exclusif de la NSA.

Partie 1: le traitement des animaux et de préparation des tissus

Le cerveau d'un singe adulte vervet (Cercopithecus aethiops) est utilisé pour le présent Protocole. Toutes les procédures sont menées en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) pour l'utilisation et le soin des animaux en recherche biomédicale ^1.

1. Des animaux est profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu'à ce que complètement exsangue.
2. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre).
3. Le cerveau est placé dans externalisée classés solutions de saccharose PBS tamponné (10, 20 et 30%, dans la séquence) contenant de l'azoture de sodium à 0,02% et maintenu à 4 ˚ C jusqu'à ce que le cerveau tombe au fond du conteneur. La solution est remplacé tous les quelques jours jusqu'à ce cerveau subit le gel de sectionnement.
4. Le cerveau est envoyée aux Associés de NeuroScience (NSA; Knoxville, TN) pour être soumis à leurs propriétaires MultiBrain ™ enrobage et le gel de sectionnement de la technologie.
5. Sept points de repère d'alignement (7) sont placés dans la matrice d'inclusion afin que les articles peuvent être orientés correctement (c'est-à-orientation gauche-droite) et re-aligné après traitement histologique est terminée.
6. Les blocs congelés est numériquement photographié à la face du bloc avant chaque section de série sont collectées à partir du bloc. Les images numériques ainsi que des sections à partir de ce cerveau peut ensuite être utilisé pour la reconstruction 3D des cartes anatomiques et histologiques, respectivement.
7. Serial flottant coupes coronales, sur une épaisseur de 50 microns par section, sont collectés par l'ensemble du cerveau.

Partie 2: traitement histologique

Les articles sont choisis à un intervalle donné spatiales (par exemple, 500 um) et pour nos fins expérimentales ont été traitées avec les anticorps suivants: X fragile protéines retard mental (FMRP; Chemicon; Temecula, Californie), SMI32 (Sternberger monoclonaux Inc; Baltimore, MD), et NeuN (Chemicon; Temecula, Californie). FMRP est une protéine cytoplasmique qui abondamment présente dans les neurones du cerveau normal et porteuse de permutation ^2. NeuN (noyaux neuronaux) reconnaît spécifiquement la NeuN DNA-binding protein spécifique des neurones, qui est présent dans la plupart des neurones et est distribué dans les noyaux des neurones, péricaryon et certains processus neuronaux proximale ^3. SMI-32 est un anticorps monoclonal qui reconnaît l'épitope non phosphorylée sur ^quatre protéines de neurofilaments.

1. A un intervalle de 500 um, à environ 140 sections sont utilisés par des anticorps.
2. Toutes les incubations, lavages et étapes de coloration sont effectués avec une légère agitation à l'aide des plats coloration spécialisés et paniers (HistoTools; Knoxville, TN).
3. Les articles sont d'abord incubées dans une solution contenant 0,1 M PBS/0.3% de Triton X-100 (TX) / 5% de sérum normal enrouée (NHS) pendant 60 min, afin de réduire la liaison non spécifique des molécules d'anticorps et une coloration de fond qui en résulte.
4. Les articles marqués d'immunomarquage FMRP subir une étape supplémentaire de la récupération d'antigène en utilisant la solution démasquage antigénique (Vector Labs; Burlingame, CA) conformément aux instructions du fournisseur.
5. Les articles sont ensuite incubés pendant la nuit et des jours différents dans leurs solutions d'anticorps respectifs contenant 0,1 M PBS/0.3% TX / NHS 3% (avec un facteur de dilution de 1 / 5, 000 pour la FMRP et SMI-32 et 1 / 2, 000 pour les anticorps NeuN.
6. Le lendemain, les articles sont lavés pendant trois périodes de 10 min dans une solution de lavage (0,1 M PBS/0.3% TX) suivie d'une incubation de 2 h à température ambiante dans biotinylé anti-souris anticorps secondaire soulevée dans cheval (Vector Labs, 1 / 1000 de dilution de 0,1 M PBS/0.3% NHS TX / 3%).
7. Après une autre série de trois lavages de 10 min, les sections sont placées dans une solution de complexe avidine-biotine peroxydase de raifort conjuguée (Vector Labs) pendant 1 h à température ambiante.
8. Enfin, après une autre série de lavages, les sections sont soumis pendant 10 min à un dia de nickel amélioréeminobenzidine (Ni-DAB) la réaction qui produit un bleu tache sombre dans les neurones immunoréactifs.
9. A l'issue de la procédure histologique, les sections sont montées sur des lames de verre enduit de gélatine.
10. Toutes les sections sont séchés à l'air pendant la nuit et lamelle, conformément aux procédures standard.

Partie 3: Résultats du représentant:

Cette méthode produit un profil d'expression complète d'une protéine cible d'intérêt à travers un cerveau de singe entier. Ici, nous montrons que les coupes coronales représentatifs fournissent un instantané de la FMRP, NeuN et SMI32 expression dans le cerveau du singe même.

Figure 1: Plateaux de coloration (A) et le panier (B) utilisé pour le traitement par lots à grande échelle de flottant des sections pour immunodétection.

Figure 2: Représentant coupes coronales d'un cerveau de singe vervet colorées pour FMRP (A), NeuN (B) et SMI32 (C) anticorps.

Il ya deux étapes essentielles de cette procédure qui font à grande échelle de détection des protéines dans un cerveau de singe toute possible. L'un est le protocole enrobage et de sectionnement, qui reste le savoir-faire exclusif de la NSA. L'autre est l'utilisation de bacs de coloration et paniers fournis par HistoTools. Ce dernier permet une manipulation facile et rapide d'un grand nombre (~ 40) sections à un moment donné. Il fournit également les moyens de traiter uniformément toutes les sections à travers le cerveau et en fait un traitement scientifiquement histologiques sonore. En outre, l'utilisation de points de repère intégré offre l'avantage supplémentaire d'être en mesure d'acquérir les modèles numériques à partir de diapositives coloration séchées et lamelle et de soumettre les fichiers numérisés à diverses formes d'analyses. Bien que nous fournissent des exemples de trois anticorps, cette procédure peut être appliquée à un large éventail de protéines cibles ainsi que d'autres colorants histologiques, en particulier ceux qui révèlent la cytoarchitecture différentes aires corticales et donc utilisés à des fins de cartographie.