JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

1,2, 2, 1,2

1Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University, 2Boyce Thompson Institute for Plant Research

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.161.181.49, User IP: 54.161.181.49, User IP Hex: 916567345

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    وصف لطريقة التي يسببها الفيروس الجين (VIGS) لإسكات أسفل طرق التعبير الجيني في

    Date Published: 6/10/2009, Issue 28; doi: 10.3791/1292

    Cite this Article

    Velásquez, A. C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato. J. Vis. Exp. (28), e1292, doi:10.3791/1292 (2009).

    Abstract

    تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هي محددة للغاية إسكات الجينات الظاهرة سببها الرنا المزدوج الجديلة 1. هذه الآلية إسكات يستخدم اثنين من الفئات الكبرى من المنظمين RNA : microRNAs ، والتي يتم إنتاجها من البروتين غير ترميز الجينات وقصيرة الرناوات التدخل (siRNAs). استخدام النباتات لمكافحة رني ترانسبوزونات وممارسة رقابة مشددة على عمليات التنمية مثل تشكيل هيئة زهرة نبات 2،3،4 والتنمية. النباتات أيضا استخدام رني للدفاع عن أنفسهم ضد عدوى الفيروسات. وبالتالي ، تطورت العديد من الفيروسات المكثفات من إسكات جينات للسماح بنجاح استعمارها المضيفة 5.

    فيروس من صنع إسكات الجينات (VIGS) هو الأسلوب الذي يستفيد من رني بوساطة محطة الآلية الدفاعية المضادة للفيروسات. في النباتات المصابة بفيروسات معدلة وتستهدف على وجه التحديد آلية ضد الجينوم الفيروسي. ومع ذلك ، مع ناقلات تحمل الفيروس تسلسل الجينات المستمدة من المضيف ، ويمكن بالإضافة إلى ذلك استهدفت عملية ضد mRNAs المضيف المطابق. وقد تم تكييفها لVIGS عالية الإنتاجية الجينوميات الوظيفية في النباتات باستخدام محطة الممرض المورمة الأجرعية لتسليم عبر تي في البلازميد ، وهو فيروس المؤتلف تحمل كامل أو جزء من تسلسل الجينات المستهدفة لإسكات. النظامية انتشار الفيروس وآلات مصنع الذاتية رني رعاية بقية. ويتم إنتاج dsRNAs المقابلة لهدف والجينات المشقوق ثم بواسطة المقامر ريبونوكلياز في siRNAs من 21-24 النيوكليوتيدات في الطول. هذه النهاية siRNAs دليل الحمض النووي الريبي التي يسببها إسكات المعقدة (RISC) أن تتحلل نص الهدف 2.

    وقد استخدمت ناقلات مختلفة في VIGS ويستند واحدة من أكثر استخداما على التبغ حشرجة فيروس (TRV). TRV هو فيروس الثنائية ، وكما ألف اثنين من الممثلين ، ومختلف تستخدم سلالات المورمة لVIGS. واحد يحمل pTRV1 ، الذي يشفر وظائف النسخ والحركة الفيروسية في حين أن الآخر ، pTRV2 والموانئ معطف البروتين وتسلسل المستخدمة لVIGS 6،7. تلقيح benthamiana نيكوتيانا وشتلات الطماطم مع خليط من سلالات النتائج سواء في إسكات الجينات. يستخدم إسكات الجين phytoene الذاتية (PDS) desaturase ، والذي يسبب photobleaching ، بوصفها لمراقبة كفاءة VIGS. وتجدر الإشارة إلى أنه ، مع ذلك ، أن إسكات في الطماطم هي عادة أقل كفاءة مما كان عليه في N. benthamiana. وينبغي دائما RNA فرة نسخة من هذا الجين من الفائدة يمكن قياسها للتأكد من أن الجينات المستهدفة أسفل تم بكفاءة التنظيم. ومع ذلك ، تسلسل الجينات غيري من N. يمكن أن تستخدم لإسكات benthamiana orthologs كل منهما في الطماطم ، والعكس بالعكس 8.

    Protocol

    الجزء 1 : المواد النباتية

    يجب ن النباتات المستخدمة لإسكات benthamiana يكون حوالي 2 ½ أسابيع من العمر والذي هو وقت النبتات والأولى 2 -- 4 أوراق حقيقية ظهرت. وتستخدم الطماطم (مغد lycopersicum) مصانع 7-8 ظهور آخر أيام ، عندما يترك الحقيقية لم تظهر بعد.

    الجزء 2 : VIGS

    DAY 1

    1. لكل تجربة ، وتزرع المورمة الأجرعية بايواء pTRV1 ، pTRV2 ، pTRV2 - PDS وpTRV2 في استضافة الجينات المستهدفة على لوحات أجار LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين و 100 ميكروغرام / مل من الريفامبيسين. والكاناميسين يختار لبلازميد pTRV في حين أن ريفامبيسين يفعل ذلك لالأجرعية. احتضان لوحة على 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
      وإسكات PDS تسبب النباتات لphotobleach ويستخدم كعنصر تحكم الكفاءة إسكات. أيضا ، لا بد من استنساخ الجينات لتكون downregulated الى ناقلات pTRV2. هناك عبارة متوافق pTRV2 ناقلات والتي قد تسهل الاستنساخ والتي وصفها ليو وآخرون. (2002).

    اليوم 3

    1. تطعيم (أ) 2 -- 3 مل ثقافة السائل LB مع المضادات الحيوية المذكورة أعلاه للحصول على كل من السلالات. احتضان التي تهتز عند 30 درجة مئوية لمدة 16 -- 18 ساعة ، ودورة في الدقيقة 200

    اليوم 4

    1. تطعيم (أ) 1 : 25 التخفيف من الثقافة الأولية إلى وسائل الإعلام التعريفي السائل الثانوي (IM) المراسلة الفورية مع ثقافة الكانامايسين ، ريفامبيسين و 200 ميكرومتر acetosyringone (الجداول 1 و 2 و 3). يستخدم بمثابة محفز acetosyringone من الجينات VIR من الأجرعية التي مطلوبة من أجل T - DNA نقل الى المحطة في حين أن 9 IM يحاكي البيئة واجه هذا العامل الممرض في apoplast المضيف. احتضان التي تهتز عند 30 درجة مئوية لمدة 20 -- 24 ساعة ، ودورة في الدقيقة 200

    يوم 5

    1. حصاد الخلايا centrifugating لمدة 10 دقائق في 3000 س غ. Resuspend في حجم نفسه إلى أن الثقافة الأصيلة وكان مع 10 ملي MgCl 2 و 10 ملي MES الرقم الهيدروجيني 5.5. قد تكون الخلايا vortexed برفق لresuspend لهم.
    2. Centrifugue الخلايا مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 3000 س غ. Resuspend في حجم النصف من الثقافة الأصلية ب 10 ملي MgCl2 ، 10 ملي MES الرقم الهيدروجيني 5.5.
    3. إعداد تعليق البكتيرية مع OD 600 من 0.3 لكل ثقافة البكتيرية. إضافة إلى تركيز acetosyringone النهائي من 400 ميكرومتر لثقافة pTRV1.
    4. مزج الثقافات التي تحتوي على pTRV1 وpTRV2 (أو التي تحتوي على الجين pTRV2 المصالح) في نسبة 1 إلى 1. كما تشمل الرقابة pTRV2 - PDS. يرجى ملاحظة أن تركيز acetosyringone النهائي هو الآن 200 ميكرومتر وأن لكل ثقافة وصلت الى 600 من OD 0.15.
    5. تسمية الشتلات أن تسللت مع الجينات لإسكاته ، وتاريخ التجربة.
    6. كزة حفرة في كل ورقة لتكون تسللت مع إبرة. استخدام حقنة 1 مل لا داعي لها للتسلل الى تعليق البكتيرية في الشتلات. الطماطم ، سواء النبتات التسلل بينما لN. benthamiana ، التسلل أكبر اثنين من يترك صحيحا. وينبغي أن مل من كل خمسة خليط البكتيرية تكون كافية لاختراق 15 N. وشتلات الطماطم benthamiana 25. تجنب انتقال التلوث عن طريق تغيير القفازات بين عمليات التسلل وعدم سقي النباتات حتى اليوم التالي بعد التلقيح.
    7. وتحفظ النباتات في 20-22 درجة مئوية في غرفة النمو مع طول اليوم 16 ساعة و 50 ٪ RH لأسابيع ونصف على الأقل قبل 3 يمكن استخدامها لفحوصات.

    الجزء 3 : نتائج الممثل

    الشكل 1 يوضح تجربة مع ممثل N. benthamiana نباتات الطماطم وأسكت عن نظام التوزيع العام. النباتات تظهر سمات النمط الظاهري photobleaching التي لوحظت في النباتات مع تناقص كميات من الكاروتينات. لإسكات - PDS محطات مراقبة ، ويبدأ photobleaching أن ينظر إليها في أقرب وقت بعد اسابيع من 1 ½ التسلل.

    الشكل 1Aالرقم 1B

    الشكل 1. إسكات الجينات السيطرة PDS أسباب photobleaching في benthamiana N. (A) ونباتات الطماطم (B). وقد اتخذت صورا أسابيع ½ 3 بعد إسكات.

    الجدول 1. إعداد متوسطة التعريفي (IM).

    400 مل المقطر H 2 O
    4.88 ز MES (2 -- 4 (morpholino) - الإيثان حمض السلفونيك)
    2.5 غرام جلوكوز
    0.12 ز ناه 2 ص 4

    جلب إلى الحجم النهائي من 475 مل مع DH 2 O وضبط درجة الحموضة إلى 5.6. الأوتوكلاف. بعد تبريده والمتوسطة ، إضافة 25 مل من الأملاح AB 20X.

    الجدول 2. تحضير الأملاح AB.

    20 غراما NH 4 الكلورين
    6 ز MgSO 4 · 7H 2 O
    3 ز بوكل
    0.2 غرام CaCl 2
    0.05 غ FeSO 4 · 7H 2 O

    جلب إلى الحجم النهائي 1 لتر بالماء المقطر. الأوتوكلاف. أن تدرك أن أملاح تترسب AB بوصفه مسحوق البرتقال. مزيج جيد من قبل منهم فقط دوامات قبل استخدامها.

    الجدول 3. إعداد Acetosyringone 200 ملم. يرجى ملاحظة أنه ينبغي إعداد acetosyringone اليوم سيتم استخدامها.

    19.6 ملغ Acetosyringone (3 '، 5' - Dimethoxy - 4' - hydroxyacetophenone)
    500 ميكرولتر DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    فيروس من صنع إسكات الجين هو الأسلوب الذي يسمح السريع شاشات الجينية العكسية. انها تتجنب توليد T - DNA أو الجينات بوساطة ينقول تدق الرافضة ، والتي لا تتوفر إلا في بعض النباتات مثل الذرة وArabidopsis. انها تلتف أيضا عملية تستغرق وقتا طويلا لتحويل النباتات ويسمح للاستهداف جينات متعددة في الوقت نفسه ، شريطة أن يكون لديهم ما يكفي من التماثل 10 أو أن يتم ترتيب تسلسل هدف المضيف مختلفة جنبا إلى جنب في إسكات ناقلات 6 و 11.

    ومع ذلك ، لا يتم اسكات 100 ٪ كفاءة ، وبالتالي ، يجب توخي الحذر عند تفسير النتائج. قد تكون نتيجة سلبية تشير ببساطة أن تركيز البروتين المتبقية كانت كافية لتنفيذ مهمتها دون عواقب المظهري واضحة. أيضا ، بعض ثوابت هي أفضل من غيرها في إسكات ذلك فمن المستحسن دائما لاستخدام اثنين على الأقل من مناطق مختلفة مرنا لإنشاء بنيات لكل إسكات الجينات. وعلاوة على ذلك ، هناك دائما إمكانية خارج الهدف إسكات إذا كان هناك ما يكفي من التماثل مع الجين بناء إسكات أو إذا siRNAs الثانوية ، مما قد يؤدي إسكات متعدية ، وتنتج 12. هذا ينطبق خصوصا للعائلات الجينات. ولذلك فمن الأهمية بمكان لتحديد كفاءة إسكات الجينات التي تستهدفها ، وبعيدا عن الهدف ، إما بواسطة RT - PCR أو تحليلات طخة الشمالية. إذا ما تم اختيار RT - PCR كطريقة لتقدير كفاءة VIGS ، ينبغي للمرء من الاشعال يصلب على الجينات خارج المنطقة المستهدفة لإسكات بحيث لا يتم محضر التي تنتجها الفيروس أيضا وتضخيم النتائج تعكس حقا من dowregulation جينات معينة الذاتية.

    VIGS الكفاءة هي دائما أكبر في N. benthamiana مما هو عليه في الطماطم. ولذلك ، يجب اتخاذ الحذر عند إسكات شتلات الطماطم. في الطماطم ، فمن الأهمية بمكان اختيار النباتات الحق المرحلة التنموية والحفاظ على الظروف البيئية المناسبة لانتشار الفيروس. أيضا ، يجب إجراء نسخة الجين وفرة لكل محطة قيد الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، عادة في VIGS الطماطم ، وألف المورمة السلالة GV3101 بينما في N. وتستخدم إما benthamiana GV3101 أو GV2260 6،13. فمن الممكن لإسكات الجين توظيف تسلسل غيري من نوع آخر ، شريطة أن يكون هناك ما يكفي من التماثل بين البلدين. أيضا ، عند بناء ناقلات الجينات pTRV2 المستهدفة ، وينبغي أن يكون في أطوال إدراج مجموعة من 2-100 غليان ، وينبغي ألا تشمل مناطق homopolymeric (مثل بولي وذيول) 14.

    إذا أصبحت ملوثة الثقافات تحمل pTRV2 مع الجينات في المصالح مع نظام التوزيع العام ، وسوف تكون في بعض الأحيان يلاحظ أي photobleaching. بدلا من ذلك ، فإن المصانع لا أقصر قامة. لذا ، من الأهمية بمكان للحد من أي مصدر من مصادر التلوث عبر خلال التجربة التي يمكن أن يحتمل التحيز النتائج.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Acknowledgements

    نشكر الدكتورة باتريشيا Manosalva لرؤى لها قيمة على المخطوطة. تم توفير التمويل من قبل البرنامج الوطني لمؤسسة العلوم النباتية الجينوم ، وعدد الجوائز DBI - 0605059.

    References

    1. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17, 449-459 (2001).
    2. Carrington, J. C. & Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science 301, 336-338 (2003).
    3. Chen, X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science 303, 2022-2025 (2004).
    4. Palatnik, J. F. et al. Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature 425, 257-263 (2003).
    5. Brigneti, G. et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).
    6. Liu, Y., Schiff, M. & Dinesh Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant Journal 31, 777-786 (2002).
    7. MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).
    8. Senthil-Kumar, M. et al. A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytol. 176, 782-791 (2007).
    9. McCullen, C. A. & Binns, A. N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).
    10. Rosebrock, T. R. et al. A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature 448, 370-374 (2007).
    11. Miki, D., Itoh, R. & Shimamoto, K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).
    12. Voinnet, O. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).
    13. Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh Kumar, S. P. & Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
    14. Liu, E. & Page, J. E. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant. Methods 4, 5 (2008).

    Comments

    2 Comments


    very nice but give free to students.....................
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 13, 2010, 10:29 PM

    i need this video.thanks for your help
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 4, 2011, 4:42 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter