Вирус-индуцированные генов (VIGS) в Nicotiana benthamiana И томатный

Часть 1: Завод материал

Н. benthamiana растений, используемых для глушителей должна быть около 2 ½ недель которая когда семядоли и первые 2 - 4 настоящих листьев появились. Томатный (Solanum Lycopersicum) растения используются 7 - 8 дней после появления, когда настоящие листья еще не появились.

Часть 2: VIGS

ДЕНЬ 1

1. Для каждого эксперимента, Agrobacterium tumefaciens укрывательство pTRV1, pTRV2, pTRV2-ПДС и pTRV2-хозяин гена-мишени выращивают на LB агаром дополнена с 50 мкг / мл канамицина и 100 мкг / мл рифампицина. Канамицин выбирает для pTRV плазмиды в то время как рифампицин, делает это для Agrobacterium. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 2 дней.
   Отключение ПДС вызовет растений photobleach и используется в качестве глушителей эффективности контроля. Кроме того, гены однако снижается должны быть клонированы в pTRV2 вектор. Существует шлюз совместимы pTRV2 вектор, который может облегчить клонирование и описывается Liu и соавт. (2002).

ДЕНЬ 3

1. Привить 2 - 3 мл жидкости культуры LB с вышеупомянутыми антибиотиками для каждого из штаммов. Инкубируйте при встряхивании при температуре 30 ° С в течение 16 - 18 часов и 200 оборотов в минуту

ДЕНЬ 4

1. Привить 1: 25 разбавления первичной культуры в жидкой среде вторичные индукционные (IM) IM культуры с канамицин, рифампицин и 200 мкМ acetosyringone (табл. 1, 2 и 3). Acetosyringone используется как индуктор вир генов Agrobacterium, которые требуются для Т-ДНК в передаче завода в то время как ⁹ IM имитирует среду этого патогена встречах в принимающей апопласт. Инкубируйте при встряхивании при температуре 30 ° С в течение 20 - 24 часов и 200 оборотов в минуту

ДЕНЬ 5

1. Урожай клеток centrifugating течение 10 минут при 3000 х г. Ресуспендируют в том же объеме, что самобытная культура была 10 мМ MgCl _2, 10 мМ MES рН 5,5. Ячейки могут быть аккуратно перемешивают для ресуспендирования них.
2. Centrifugue клетки в течение 10 минут при 3000 х г. Ресуспендируют в половину объема самобытная культура, с 10 мМ MgCl2, 10 мМ MES рН 5,5.
3. Подготовка бактериальной суспензии с OD ₆₀₀ в размере 0,3 для каждой бактериальной культуры. Добавить acetosyringone до конечной концентрации 400 мкМ до pTRV1 культуры.
4. Смешайте культур, содержащих pTRV1 и pTRV2 (или pTRV2 содержащего ген интереса) в 1 к 1 отношение. Также включите pTRV2-ПДС контроля. Обратите внимание, что конечная концентрация acetosyringone сейчас 200 мкМ и что каждая культура находится в OD ₆₀₀ составляет 0,15.
5. Этикетка саженцы должны быть проникли с геном молчать и дата эксперимента.
6. Пока отверстие в каждый лист быть проникли с помощью иглы. Используйте 1 мл шприца ненужных для проникновения бактериальной суспензии в рассады. Для помидоров, проникнуть как семядоли в то время как для N. benthamiana, проникнуть крупнейших два настоящих листа. Пять мл каждой бактериальной смеси должно быть достаточно, чтобы проникнуть N. 15 benthamiana и 25 рассаду помидор. Избегайте перекрестного загрязнения путем изменения перчатки между инфильтрации и не полива растений, пока на следующий день после прививки.
7. Растения хранятся при температуре 20 - 22 ° С в ростовой камере с 16 часов длины дня и относительной влажности 50% в течение по крайней мере, на 3 с половиной недель, прежде чем они могут использоваться для анализа.

Часть 3: Представитель результаты

На рисунке 1 показана представитель эксперимент с Н. benthamiana и томатов замолчать для PDS. Растения показывают характерные фотообесцвечивания фенотип наблюдается у растений с уменьшенным количеством каротиноидов. Для PDS-замолчать контрольных растений, фотообесцвечивания начинает рассматриваться, как только 1 ½ недель после инфильтрации.

Рисунок 1. Отключение гена контроля PDS причины фотообесцвечивания в Н. benthamiana (А) и томатный (B) растений. Фотографии были взяты три с половиной недель после глушителя.

Таблица 1. Подготовка индукционные Средняя (IM).

Довести до конечного объема 475 мл с дН ₂ O и отрегулировать рН до 5,6. Автоклав. После среда остынет, добавить 25 мл 20X соли АВ.

Таблица 2. Подготовка соли АВ.

Довести до конечного объема 1 литра дистиллированной водой. Автоклав. Помните, что AB солей осаждаются в виде оранжевого порошка. Просто смешайте их хорошо закрученной до их использования.

Таблица 3. Подготовка 200 мМ Acetosyringone. Обратите внимание, что acetosyringone должны быть подготовлены день он будет использоваться.

Вирус-индуцированные генов является метод, который позволяет быстро обратный генетический экранов. Он избегает поколения Т-ДНК или транспозонов опосредованной генной заглушками, которые доступны только в некоторых растениях, как Arabidopsis и кукурузы. Он также обходит трудоемкий процесс трансформации растений и позволяет нападения на нескольких генов в то же время, при условии, что они располагают достаточными гомологии ¹⁰ или, что различные последовательности целевого узла расположены в тандеме в глушителей ^{6 вектор, 11.}

Тем не менее, глушителей никогда не 100% эффективным и, следовательно, необходимо соблюдать осторожность при интерпретации результатов. Отрицательный результат может просто указать, что остаточная концентрация белка было достаточно, чтобы выполнять свои функции без явных фенотипических последствий. Кроме того, некоторые конструкции лучше глушителей, чем другие, поэтому всегда рекомендуется использовать как минимум два различных регионах мРНК для создания конструкций глушителей для каждого гена. Кроме того, всегда есть возможность за пределы целевых глушителей, если есть достаточные гомологии гена с глушителей построить или, если вторичные siRNAs, что может привести транзитивного глушителей, производятся ^12. Это в особенности справедливо для генной семей. В связи с этим первостепенное значение для количественной оценки эффективности глушителей вашей целевой и вне генов-мишеней, либо ПЦР-анализ или Северной блот. Если RT-PCR выбран как метод оценки эффективности VIGS, один из праймеров должны отжигать на ген за пределами региона, предназначены для глушителей, так что запись производится путем вирус также не усиливается и результаты действительно отражают dowregulation из частности эндогенных генов.

VIGS эффективности всегда больше в Н. benthamiana, чем в помидор. Поэтому осторожность должна быть взята, глушителей рассады томатов. В помидор, очень важно правильно выбрать растение стадии развития и поддержания надлежащего состояния окружающей среды для вирусного распространения. Кроме того, обилие генов стенограммы должны быть выполнены для каждого растения в стадии изучения. Кроме того, обычно в томатном VIGS, А. tumefaciens штамма GV3101 то время как в Н. benthamiana либо GV3101 GV2260 или используются ^6,13. Вполне возможно, чтобы заставить замолчать ген использовании гетерологичной последовательности из другого вида, если имеются достаточные гомологии между ними. Кроме того, при построении pTRV2-гена-мишени, вектор, длина вставки должна быть в диапазоне от 200 до 1000 б.п., и они не должны включать в себя гомополимерных регионах (например, поли хвосты) ^14.

Если культур проведения pTRV2 с генами интерес подвергнуться заражению ПДС, иногда нет фотообесцвечивания будет наблюдаться. Вместо этого, растения будут иметь невысоких мужчин. Поэтому, крайне важно, чтобы свести к минимуму любые источники перекрестного заражения во время эксперимента, который потенциально может смещения результатов.