蛋白泛素化的检测

在培养细胞中检测蛋白的泛素化

1. 与表达的蛋白（抗原表位标签的版本）泛的质粒转染培养细胞。
2. 请完整的细胞裂解液（2％十二烷基硫酸钠，氯化钠150毫米，10毫米的Tris - HCl，pH值8.0）2MM钒酸钠，50毫米氟化钠，和蛋白酶抑制剂。
3. 裂解细胞，每盘100μL细胞裂解液（6厘米菜）。如果使用一个更大的盘，相应地调整音量。仔细旋流菜让裂解液覆盖整个区域的细胞生长。
4. 与细胞刮刀收集细胞和细胞裂解液转移到1.5 mL Eppendorf管。管放置到一个热点板块，立即煮沸10分钟。
5. 剪切细胞与超声设备。
6. 加入900ul稀释缓冲液（10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，氯化钠150毫米，2毫米EDTA，1％的Triton）。在4 ° C孵育30-60分钟与旋转样品。
7. 在20,000 30分钟XG的旋转稀释样品。导致上清转移到一个新的Eppendorf管。要小心不要去打扰颗粒。
8. 测定蛋白浓度。
9. 准备对一个或G琼脂糖珠共轭抗体在兼容的缓冲液（50％浆）的目标蛋白的蛋白质。切窄的一端和一个P - 200枪头14-20树脂液转移到500-1,500微克准备的免疫细胞裂解液。细胞转染效率高，500微克就足够了。对于细胞的转染效率低，可能需要更多的蛋白质。
10. 在4 ° C过夜旋转培养的细胞裂解液珠的混合物。
11. 离心5分钟在5000 XG珠。吸出上清液。洗净树脂洗涤缓冲液（10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，1 M氯化钠，1毫米EDTA，1％NP - 40）的两倍。
12. 旋转作最后一次为30秒20,000 XG珠。吸残留的洗涤液和2X SDS上样缓冲液煮沸的树脂。
13. 装载到SDS - PAGE凝胶免疫分析的样品。
14. 检测泛素和相应的抗体与靶蛋白。对于免疫印迹，我们一般先检测泛素。膜会被用来检测蛋白质的沉淀。

在体外泛素化实验检测靶蛋白通过泛素化

1. 设为5X泛素化缓冲液（100毫米的Tris - HCl，pH值7.5，25毫米氯化镁，数码地面电视的2.5毫米，10毫米ATP）。储存在-20 ° C长达6个月的小等分。有些协议也添加到缓冲区ATP再生^1,2磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶。
2. 对于每一个反应，准备的混合物，包含以下内容：
   

   8μL	5X泛素缓冲区
   250吴	泛素E1
   500吴	泛素E2
   0.5微克	泛
   0.5微克	蛋白质的利益
   	水至40μL总体积

   作为对照，无论是E1，E2或泛的情况下，准备在类似的反应。
3. 混合物在37℃，1小时或更长的时间。
4. 加入SDS - PAGE样品缓冲液停止反应，煮沸10分钟的样品。
5. 加载到SDS - PAGE电泳，免疫印迹分析的样品。
6. 检测泛素和相应的抗体与靶蛋白。

在此演示中，我们首先描述的步骤，允许检测的兴趣培养的哺乳动物细胞中的蛋白质的泛素修饰。为了检测蛋白质的利益，不会对非共价键相互作用的蛋白质，泛素化，特别是，我们用一个严格的条件下裂解细胞，免疫沉淀和^洗涤 1,3 。泛素化，反泛素免疫印迹在这样一个苛刻的条件的目标蛋白的免疫检测，因此可能是特定目标蛋白质。为了防止在实验过程中的蛋白质deubiquitination， 如 N - ethylmaleimide和泛醛酶抑制剂deubiquitinating可能被添加到所有^的缓冲区4。然而，这是不太可能的，煮沸10分钟后程序deubiquitination酶保持活跃。强涂片或分子高的梯子，是典型的泛素化的结果。感兴趣的蛋白质的泛素化程度，可以在几个实验条件下通过比较靶蛋白泛素/未修改的比例分摊。同时，自由的泛素分子一般都减少了，当靶蛋白的泛素化是增加。这个协议也是有用的检测泛素样小分子修饰，如sumolyation和neddylation。

我们还介绍了使用纯化或重组蛋白在体外泛素化检测。不同的抗原表位标签的泛素化组件均为市售。泛素E3连接酶是没有必要在体外泛素共轭。