Protein Ubikitinasyon Tespiti

Kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon Tespiti

1. Protein ve ilgi (epitopu etiketli sürümü) ubikuitin ifade plazmid Transfect kültür hücreleri.
2. Tam hücre lizis tamponu (% 2 SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 2mm sodyum orthovanadate, 50 mM sodyum florür, ve proteaz inhibitörleri ile.
3. Plaka başına 100 ul hücre lizis tamponu (6 cm çanak) olan hücreler Lyse. Daha büyük bir çanak kullanılırsa, buna göre ses seviyesini ayarlayın. Swirl çanak lizis tamponu dikkatle yetiştirilen hücreler, tüm alanı kapsayacak.
4. Bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve hücre lizatları 1,5 ml Eppendorf tüp içine aktarmak. Tüp 10 dakika kaynatın hemen sıcak bir tabağa yerleştirin.
5. Kesme sonication cihaz ile hücreleri.
6. 900ul seyreltme tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA,% 1 Triton) ekleyin. Rotasyon ile 30-60 dakika boyunca, 4 ° C'de örnek inkübe edin.
7. 30 dakika 20.000 xg'de seyreltilmiş örnekleri Spin. Meydana gelen supernatant, yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.
8. Protein konsantrasyonu ölçün.
9. Protein A-veya G-agaroz boncuk-konjuge antikor (% 50 bulamaç) uyumlu bir tampon hedef proteinine karşı hazırlayın. P-200 pipet ucu dar ucu ve reçine 14-20 ul immunoprecipitation için hazırlanan hücre lizatları 500-1,500 mg aktarmak. Transfeksiyon verimliliği yüksek olan hücreler için, 500 mg yeterli olacaktır. Transfeksiyon verimliliği düşük olan hücreler için daha fazla proteine ​​ihtiyaç olabilir.
10. 4 ° C gecede rotasyon ile hücre lizat-boncuk karışımı inkübe edin.
11. 5 dakika için 5000 xg'de boncuk aşağı spin. Süpernatant aspire. Reçine yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40) iki kez yıkayın.
12. Son bir kez 30 saniye süreyle 20.000 xg'de boncuk Spin. Artık yıkama tampon aspire ve 2X SDS yükleme tamponu ile reçine kaynatın.
13. SDS-PAGE jel üzerine örnekler, analiz immunoblotting için yükleyin.
14. Ubikuitin ve hedef protein antikorlar algılar. Immunoblotting için, genellikle ilk ubikuitin algılar. Membran protein çöktürülmüş algılamak için kullanılan olacak.

In vitro ubikuitinasyon tahlil yoluyla hedef protein ubikuitinasyon Tespiti

1. 5X ubikuitinasyon tampon (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP) olun. 6 ay, -20 ° C'de küçük alikotları saklayın. Bazı protokoller de, ATP ^rejenerasyon 1,2 tampona kreatin fosfat ve kreatin kinaz ekleyin .
2. Her reaksiyon için, aşağıdaki maddeleri içeren bir karışım hazırlayın:
   

   Ul 8	5X ubikuitinasyon tamponu
   250 ng	ubikuitinasyon E1
   500 ng	ubikuitinasyon E2
   0.5 mg	ubikuitin
   0.5 mg	ilgi protein
   	40 ul toplam hacim su

   Kontrol grubu olarak benzer reaksiyonlar, E1, E2, ya da ubikuitin yokluğunda hazırlar.
3. 1 saat veya daha uzun süre için 37 ° C karışımı inkübe edin.
4. SDS-PAGE örnek tampon ekleyerek reaksiyon durdurun ve örnek 10 dakika kaynatın.
5. SDS-PAGE jel üzerine örnekler, analiz immunoblotting için yükleyin.
6. Ubikuitin ve hedef protein antikorlar algılar.

Bu sunumda, öncelikle, kültürlü memeli hücrelerinde ilgi bir protein ubikuitin bir değişiklik olup olmadığını saptamak izin adımları nitelendirdi. Non-kovalent etkileşen proteinler üzerinde ilgi protein, özellikle ubikuitinasyon tespit etmek için, hücre parçalama, immunoprecipitation ve ^1,3 yıkama için sıkı bir durum kullanılır. Bu nedenle, anti-ubikuitin immün böyle sert bir durumda hedef protein immunoprecipitation tarafından tespit Ubikitinasyon, hedef proteine ​​özgü olması muhtemeldir. Deneysel işlemleri sırasında protein deubiquitination önlemek için, N-ethylmaleimide ve ubikuitin aldehit gibi deubiquitinating enzim inhibitörleri Tüm tamponları ⁴ eklenebilir. Ancak, 10 dakika kaynar işlemden sonra aktif deubiquitination enzimleri kalması olası değildir. Güçlü lekelenme veya merdiven yüksek moleküler türlerin genellikle ubikuitinasyon sonucu. Ilgi protein ubikuitinasyon derecesi birkaç deney koşullarında ubiquitinated / değiştirilmemiş hedef protein oranı karşılaştırılarak tespit edilebilir. Bu arada, hedef protein ubikuitinasyon arttığında ücretsiz ubikuitin moleküller genellikle azalır. Bu protokol aynı zamanda sumolyation ve neddylation gibi diğer ubikuitin gibi küçük molekül değişikliği tespit etmek için yararlıdır.

Ayrıca arıtılmış veya rekombinant proteinleri kullanılarak in vitro ubikuitinasyon tayininde bir tarif. Çeşitli epitopu etiketli ubikuitinasyon bileşenleri ticari olarak kullanılabilir. Ubikitinasyon E3 ligaz in vitro ubikuitin konjugasyon için gerekli değildir.