The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Psychology, Neuroscience and Cognitive Science Program , University of Maryland
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Herberholz, J. Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals. J. Vis. Exp. (29), e1297, doi:10.3791/1297 (2009).
तंत्रिका गतिविधि और इसी व्यवहार अभिव्यक्ति के पैटर्न के बीच संबंधों को अनर्गल पशुओं में स्थापित करने के लिए मुश्किल है. पारंपरिक गैर इनवेसिव तरीकों कम से कम आंशिक रूप से स्र्द्ध अनुसंधान के विषय की आवश्यकता होती है, और वे केवल एक साथ सक्रिय न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या की पहचान की अनुमति. दूसरी ओर, न्यूरॉन्स या व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के छोटे ensembles केवल काफी हद तक कम की तैयारी से प्राप्त एकल कक्ष रिकॉर्डिंग का उपयोग कर मापा जा सकता है. प्राकृतिक व्यवहार की अभिव्यक्ति के बाद से रोका और dissected पशुओं में सीमित है, अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र है कि इस तरह के व्यवहार नियंत्रण की पहचान करने के लिए मुश्किल हैं.
यहाँ, मैं एक गैर इनवेसिव शारीरिक तकनीक है कि स्वतंत्र रूप से जानवरों का बर्ताव में तंत्रिका सर्किट सक्रियण को मापने की अनुमति देता उपस्थित थे. पानी भरा कक्ष के अंदर तार इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का उपयोग करना, स्नान इलेक्ट्रोड तंत्रिका और मांसपेशियों क्षेत्र प्राकृतिक या प्रयोगात्मक पैदा बच प्रतिक्रियाओं के दौरान किशोर क्रेफ़िश द्वारा उत्पन्न क्षमता रिकॉर्ड. क्रेफ़िश के प्राथमिक बच प्रतिक्रियाओं पूंछ - flips जो जानवरों की उत्तेजना के बिंदु से दूर हटो तीन अलग अलग प्रकार के द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. पूंछ - फ्लिप के प्रत्येक प्रकार की अपनी तंत्रिका सर्किट द्वारा नियंत्रित किया जाता है, दो सबसे तेजी से और सबसे शक्तिशाली भागने प्रतिक्रियाओं बड़े आदेश न्यूरॉन्स के विभिन्न सेट के सक्रियण की आवश्यकता होती है. व्यवहार टिप्पणियों के साथ संयोजन में, स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग इन न्यूरॉन्स की स्पष्ट पहचान और संबद्ध तंत्रिका सर्किट की अनुमति देते हैं. इस प्रकार तंत्रिका स्वाभाविक रूप से घटनेवाला व्यवहार अंतर्निहित circuitry के गतिविधि अनर्गल पशुओं में है और अलग अलग व्यवहार संदर्भों में मापा जा सकता है.
भाग 1: रिकॉर्डिंग कक्ष
भाग 2: स्नान इलेक्ट्रोड और जमीन तार
भाग 3: स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग
भाग 4: उत्तेजक जांच
भाग 5: वीडियो रिकॉर्डिंग
भाग 6: प्रायोगिक प्रक्रिया
भाग 7: डेटा विश्लेषण
8: भाग प्रतिनिधि परिणाम
सिर या एक किशोर क्रेफ़िश की पूंछ (छवि 2) के लिए दिया एक स्पर्श उत्तेजना के जवाब में एक उच्च गति वीडियो फ्रेम और पूंछ - फ्लिप भागने के लिए इसी बिजली के क्षेत्र रिकॉर्डिंग की एक श्रृंखला.
चित्र 2A: मजबूत सिर को स्पर्श उत्तेजना पैदा एक औसत दर्जे का विशाल सर्किट द्वारा नियंत्रित पूंछ - फ्लिप. विशाल (तारांकनों) न्यूरॉन और बड़े phasic विक्षेपन है कि इस प्रकार के रिकॉर्ड स्पाइक की पहचान गैर अस्पष्ट पूंछ फ्लिप विशाल न्यूरॉन गतिविधि द्वारा मध्यस्थता के रूप में सक्षम बनाता है. पिछड़े वीडियो निशान में दिखाया आंदोलन सक्रिय तंत्रिका सर्किट (एमजी) की पहचान निर्धारित करता है.
चित्र 2B: एक मजबूत स्पर्श उत्तेजना के बाद टेल फ्लिप पार्श्व विशाल सर्किट द्वारा मध्यस्थता पूंछ को लागू किया गया था. ऊपर और आगे वीडियो में देखा गति सिंक्रनाइज़ इलेक्ट्रॉनिक विशाल कील और बड़े, phasic प्रारंभिक विक्षेपन सक्रिय तंत्रिका सर्किट (एलजी) की पहचान निर्धारित करता है प्रदर्शित करने का पता लगाने के साथ साथ बताते हैं.
चित्र 2C: पूंछ फ्लिप गैर - विशाल circuitry द्वारा नियंत्रित है. एक और अधिक क्रमिक स्पर्श उत्तेजना जानवर की छाती के लिए दिया था. जबकि वीडियो पर कब्जा कर लिया आंदोलन सक्रिय सर्किट की स्पष्ट पहचान की अनुमति नहीं है, इलेक्ट्रॉनिक रिकॉर्डिंग एक विशाल कील की कमी है और बहुत छोटे deflections सक्रिय सर्किट (गैर - जी) की पहचान की होते हैं.
चित्र 3: भागने के सभी तीन प्रकार के लिए विलंबता माप पूंछ - flips. जांच से संपर्क करें और शारीरिक प्रतिक्रिया के बीच समय सात जानवरों के लिए मापा गया था. विशालकाय की मध्यस्थता पूंछ flips काफी गैर विशाल पूंछ flips से हासिल कर रहे हैं तेजी से.

चित्रा 1: एक रिकॉर्डिंग कुल लंबाई में 2.5-3.5 सेमी के जानवरों के लिए हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया चैम्बर के लिए एक उदाहरण है. स्नान इलेक्ट्रोड चैम्बर के विपरीत दिशा में चिपका रहे हैं जबकि जमीन तार चैम्बर के लंबे पक्ष से जुड़ा हुआ है और स्नान इलेक्ट्रोड को सीधा.
चित्रा 2: एकल वीडियो फ्रेम 1000 उत्तेजना के तीन अलग अलग प्रकार के लिए च / सेक और इसी इलेक्ट्रॉनिक रिकॉर्डिंग में दर्ज है.

ए) एक मजबूत स्पर्श उत्तेजना जानवर के सिर को दिया गया था और एक औसत दर्जे का विशाल (एमजी) पूंछ फ्लिप मध्यस्थता हासिल है . छह वीडियो फ्रेम बाईं पर प्रदर्शित कर रहे हैं. करने के लिए पशु का स्पर्श किया जाता जांच से रिकॉर्डिंग का पता लगाने भूरे रंग में दिखाया गया है, संपर्क के बिंदु काला arrowhead ने संकेत दिया है. रिकॉर्डिंग स्नान इलेक्ट्रोड के साथ प्राप्त ट्रेस नीले रंग में दिखाया गया है. इनसेट छोटे विशाल अक्षतंतु स्पाइक है कि बड़े phasic deflections पछाड़ से पता चलता है. ग्रे सलाखों वीडियो फ्रेम बाईं तरफ दिखाया गया है के अनुरूप है. क्रेफ़िश पूंछ की पहली उल्लेखनीय आंदोलन # 3 फ्रेम, सात मिलीसेकेंड में जांच के साथ संपर्क के बाद हुई.

बी) एक मजबूत स्पर्श उत्तेजना जानवर की पूंछ के लिए दिया गया था और एक पार्श्व विशाल (एलजी) हासिल मध्यस्थता पूंछ - फ्लिप . छह वीडियो फ्रेम बाईं पर प्रदर्शित कर रहे हैं. करने के लिए पशु का स्पर्श किया जाता जांच से रिकॉर्डिंग का पता लगाने भूरे रंग में दिखाया गया है, संपर्क के बिंदु काला arrowhead ने संकेत दिया है. रिकॉर्डिंग का पता लगाने के साथ प्राप्तस्नान इलेक्ट्रोड लाल रंग में दिखाया गया है. इनसेट छोटे विशाल अक्षतंतु स्पाइक है कि बड़े phasic deflections पछाड़ से पता चलता है. ग्रे सलाखों वीडियो फ्रेम बाईं तरफ दिखाया गया है के अनुरूप है. क्रेफ़िश पूंछ की पहली उल्लेखनीय आंदोलन # 3 फ्रेम, आठ मिलीसेकेंड में जांच के साथ संपर्क के बाद हुई.

सी) एक कमजोर और क्रमिक स्पर्श उत्तेजना जानवर के सिर को दिया गया था और एक गैर - विशाल (गैर जी) मध्यस्थता पूंछ - फ्लिप हासिल है . आठ वीडियो फ्रेम बाईं पर प्रदर्शित कर रहे हैं. करने के लिए पशु का स्पर्श किया जाता जांच से रिकॉर्डिंग का पता लगाने भूरे रंग में दिखाया गया है, संपर्क के बिंदु काला arrowhead ने संकेत दिया है. रिकॉर्डिंग स्नान इलेक्ट्रोड के साथ प्राप्त ट्रेस काले रंग में दिखाया गया है. ट्रेस विशाल कील क्षमता, बड़े प्रारंभिक deflections का अभाव है और बहुत छोटे आयाम की क्षमता के होते हैं. हल्की धूसर बार वीडियो फ्रेम बाईं तरफ दिखाया गया है के अनुरूप हैं. क्रेफ़िश पूंछ की पहली उल्लेखनीय आंदोलन जांच के साथ पहले से संपर्क के बाद फ्रेम # 6, 115 मिलीसेकेंड में हुई.

चित्रा 3: रिस्पांस दोनों लिंगों और इसी तरह के आकार के सात अलग - अलग जानवरों के लिए विलंबता माप (लंबाई मतलब ± stdv: 3.2 सेमी ± 0.2 सेमी, Telson करने के लिए मंच से मापा ). एमजी (नीली पट्टी) और एलजी (लाल पट्टी) पूंछ flips काफी कम की तुलना में प्रतिक्रिया सुप्तावस्था पूंछ flips गैर - जी (काली पट्टी) circuitry द्वारा मध्यस्थता. मतलब और मानक विचलन दिखाए जाते हैं. बार्स एक ही पत्र के साथ एक दूसरे से काफी अलग नहीं किया था (Wilcoxon हस्ताक्षरित श्रेष्टता श्रेणी परीक्षण जोड़ी वार, पी <0.05 तुलना के लिए).
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एकल न्यूरॉन गतिविधि या तंत्रिका सर्किट सक्रियण के गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग अनर्गल पशुओं में प्राप्त करना कठिन है. विधि यहाँ वर्णित करने के लिए स्वाभाविक रूप से व्यवहार घटनेवाला अंतर्निहित तंत्रिका सक्रियण के पैटर्न की पहचान करने का मतलब है प्रदान करता है.
अतीत में, हम सफलतापूर्वक इस तकनीक का इस्तेमाल सामाजिक प्रभुत्व एक पदानुक्रम के गठन के दौरान किशोर क्रेफ़िश के तंत्रिका बच सर्किट में गतिविधि के पैटर्न को मापने, प्राकृतिक 2 शिकारियों, और अधिक हाल ही में से हमलों के दौरान दृश्य 3 खतरों के जवाब में. वर्तमान में, हम सिंक्रनाइज़ स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग और उच्च गति वीडियो रिकॉर्डिंग का उपयोग क्रेफ़िश में बच व्यवहार के निष्पादन के दौरान सिर appendages के आंदोलनों के महत्व को मापने.
हालांकि इस तकनीक केवल दो अलग invertebrate प्रजातियों (क्रेफ़िश और dragonflies) और दो अलग अलग 4 प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है है, यह संभावना लगता है कि यह रीढ़ सहित अन्य पशु मॉडल प्रणाली है, जिनमें से कुछ जलीय और एक्सप्रेस व्यवहार है कि लागू किया जा सकता बड़े न्यूरॉन्स द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, कई teleost मछली के तेजी से भागने प्रतिक्रियाओं Mauthner कोशिकाओं, बड़े से पहचाने जाने योग्य न्यूरॉन्स 5 के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. भागने व्यवहार Mauthner कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता साहित्य में ज्यादा ध्यान प्राप्त हुआ है और विश्लेषण के कई स्तरों पर अध्ययन किया गया है, अभी तक, वहाँ सबूत है कि Mauthner कोशिकाओं स्थितियों है कि 6,7 भागने के लिए असंबंधित हैं में तेजी से शरीर बदल जाता है नियंत्रण से बढ़ रहा है. सबूत है, तथापि, ज्यादातर Mauthner सेल गतिविधि के प्रत्यक्ष माप से और व्यवहार नहीं kinematical चर की तुलना से ली गई है. यह उच्च गति वीडियोग्राफी के साथ संयोजन में स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग क्षेत्र Mauthner कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न या मांसपेशियों गतिविधि जुड़े क्षमता को मापने के लिए उपयोग संभव हो सकता है.
इसकी वैज्ञानिक मूल्य के अलावा, इस तकनीक यहाँ वर्णित भी आदर्श शिक्षा (जैसे, स्नातक शिक्षण प्रयोगशालाओं) प्रयोजनों के अपने समग्र सादगी और inexpensiveness के कारण के लिए अनुकूल है.
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पहले (1984) Fricke 8 और Beall एट अल द्वारा स्नान रिकॉर्डिंग तकनीक का इस्तेमाल किया गया था . (1990) के लिए बिजली पूंछ flips दौरान उत्पन्न क्षेत्रों उपाय 9. तकनीक और बाद में संशोधित किया गया था और अपने पूर्व स्नातक छात्र डॉ. Fadi ए Issa और अपने पूर्व postdoctoral सहयोगी डा. जेन्स Herberholz द्वारा डॉ. डोनाल्ड एडवर्ड्स (जॉर्जिया राज्य विश्वविद्यालय) की प्रयोगशाला में सुधार. इसके अलावा शोधन किया गया है और मैरीलैंड विश्वविद्यालय में नए अनुसंधान अनुप्रयोगों डा. जेन्स Herberholz की प्रयोगशाला में परीक्षण किया गया है. मैं दे मुझे प्रयोगों के साथ मदद के लिए अपने उच्च गति वीडियो प्रणाली और मेरे शोध सहायकों डेविड Rotstein और विलियम Liden का उपयोग करने के लिए मेरे सहयोगी डॉ. डेविड Yager धन्यवाद देना चाहूंगा.