Le registrazioni di attivazione circuito neurale in Liberamente Comportarsi Animali

Parte 1: camera di registrazione

1. La camera di registrazione è di forma rettangolare ed è composta da sottili pareti di vetro. Dimensioni camera sono 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (lunghezza x larghezza x altezza) per gli animali di 2,5-3,5 lunghezza totale cm (misurata dal rostro fino telson).
   Vedi fig. 1 per un esempio di una camera usata nei nostri esperimenti.
2. In alternativa, camere di registrazione può essere fatta da altri materiali (ad esempio, non tossico in plastica trasparente). Dimensioni Camere possono variare in base alla procedura sperimentale e le camere devono essere personalizzati per ogni serie sperimentale. Per ottenere risultati ottimali, la dimensione della camera deve essere il più piccolo possibile senza frenare gli animali nel loro comportamento naturale. Come regola generale, la lunghezza e la larghezza della camera non deve essere più di tre volte le dimensioni dell'animale.

Parte 2: elettrodi bagno e filo di terra

1. Una coppia di elettrodi di registrazione e un elettrodo di massa vengono utilizzati. Elettrodi sono fatti di filo di rame isolato (26 AWG con isolamento 0,25 mm). Una estremità degli elettrodi bagno è collegato ad un amplificatore extracellulare (AM Sistemi 1700; vedi sotto) e 0,5 - 1,0 mm di isolamento sono tolto gli altri fini. Il cavo di terra è collegato alla terra dell'amplificatore o di qualsiasi altra attrezzatura a terra e 2-3 cm di isolamento è tolto l'altra estremità.
2. Elettrodi bagno e filo di terra sono attaccate alle pareti interne della camera di registrazione con colla non tossica. Elettrodi di registrazione sono posizionati centralmente su entrambi i lati corti della camera e di fronte gli uni agli altri (Fig. 1).
3. Elettrodo di massa è posizionato su un lato lungo della camera di registrazione perpendicolare agli elettrodi di registrazione (Fig. 1).
4. Camera è riempita con acqua deionizzata. I migliori risultati si ottengono con acqua ad alta resistenza (~ 18 MΩ).

Parte 3: registrazioni elettrodo Bagno

1. Uscite da elettrodi di registrazione sono amplificati (1000x) da un amplificatore extracellulare (Sistemi AM; 1700 Model). Segnale dal elettrodi di registrazione è filtrato utilizzando una combinazione di bassa frequenza (<100 Hz) e alta frequenza di cut-off (> 5 KHz). Segnale viene poi collegato ad un dispositivo di commutazione e una scheda di acquisizione dati (National Instruments). Dati digitalizzati sono registrati, memorizzati e analizzati utilizzando software di acquisizione dati (Photron Strumenti di movimento).
2. In alternativa, segnale amplificato da elettrodi di registrazione possono essere digitalizzati con altri convertitori analogico-digitale (ad esempio, MDS tecnologie di analisi; Digidata 1440) prima che i dati digitalizzati vengono registrati utilizzando altri disponibili in commercio software di acquisizione dati (ad esempio, MDS tecnologie di analisi; Axoscope).

Parte 4: Sonda Stimolare

1. Una sonda stimolante è costituito da una pipetta di vetro (14 cm di lunghezza) dotato di una coppia di elettrodi filo sottile. Punte degli elettrodi sono esposti (0,2 mm) per produrre un segnale elettronico quando l'animale viene toccato dalla sonda. Questo permette di misurare il tempo esatto di stimolazione.
2. Uscite dalla sonda stimolanti sono amplificati (1000x) da un amplificatore extracellulare (Sistemi AM; 1700 Model). Il segnale viene filtrato utilizzando una combinazione di bassa frequenza (<100 Hz) e alta frequenza di cut-off (> 5 KHz). Il segnale viene poi collegato ad un dispositivo di commutazione e di una scheda di acquisizione dati (National Instruments). Dati digitalizzati sono registrati, memorizzati e analizzati utilizzando software di acquisizione dati (Photron Strumenti di movimento).

Parte 5: Le registrazioni video

1. Una telecamera ad alta velocità video (Fastcam PCI-X 1280, Photron) è posizionato perpendicolarmente alla camera di registrazione per fornire una vista laterale. Livello di luminosità all'interno della camera di registrazione deve essere regolato per fornire i migliori risultati, per esempio utilizzando un illuminatore a collo d'oca o di altre fonti luminose attivabili.
2. Ad alta velocità videografia è combinato e sincronizzato con le registrazioni elettronica utilizzando un breakout box e acquisizione dati di bordo (National Instruments). Segnale amplificato dagli elettrodi bagno è collegato al breakout box e scheda di acquisizione dati tramite cavi BNC. Un interruttore esterno a mano trigger avvia l'acquisizione sincronizzata video e dati.

Parte 6: Procedura sperimentale

1. Un singolo animale viene introdotto nella camera e ha permesso di acclimatare per 5 minuti. Fuga di coda ribalta sono attivati ​​da rubinetti singoli di diversa intensità alla testa o all'addome, rispettivamente. L'intensità dei rubinetti è controllata dallo sperimentatore. Ogni fuga di coda flip è registrato con video ad alta velocità ad un frame rate di 1000 punti f / sec, e dei dati dei potenziali campo elettronico sono registrati a 25 kHz. Inizio del bagno e la registrazione video è iniziata da interruttore manuale su una scatola grilletto. Tempo di registrazione è determinato dalla percentuale di cornice scelta (ad esempio, 1000 f / sec = 4 secondi il tempo di registrazione totale). Post e pre-trigger tempi di registrazione possono essere selezionati.
2. None: registrazioni di elettrodi da bagno deve essere verificata una volta per ogni specie testate, combinando registrazioni elettrodo bagno con altri metodi disponibili registrazioni. In gamberi, una coppia di elettrodi d'argento può essere impiantato chirurgicamente in tutto il cordone nervoso ventrale. Stimoli abbia coda flip fuga può essere applicato e registrare tracce elettroniche di elettrodi impiantati e bagno può essere paragonato.
3. Fuga coda-flip comportamento e le corrispondenti attività neurale possono essere registrati in una varietà di contesti diversi, ad esempio, in risposta alle minacce visive, durante gli attacchi dei predatori, o durante gli incontri agonistici di due gamberi. Dimensioni della camera, modalità di registrazione, ecc deve essere regolata di conseguenza (vedi Discussione).

Parte 7: Analisi dei dati

1. Singoli fotogrammi video vengono analizzati utilizzando software di movimento (Photron). Tracce elettroniche sono utilizzate per identificare il tipo di circuito neurale che è stato attivato da ogni stimolo. Dati video viene confrontato con sincronizzato registrazioni fisiologiche per determinare il movimento dell'animale e il circuito di attivazione neurale. Ogni circuito attivato produce una caratteristica firma elettronica (vedi risultati rappresentante).
2. Latenza tra sonda a contatto e la risposta neurale / muscolari sono calcolati per ogni esperimento, misurando il ritardo tra l'inizio del segnale della sonda e l'inizio del segnale registrato con gli elettrodi bagno.

Parte 8: I risultati rappresentativi

Una serie di singoli ad alta velocità fotogrammi video e le corrispondenti registrazioni di campo elettrico per la fuga di coda-flip in risposta ad uno stimolo tattile consegnato alla testa o coda di un gambero giovanile (Fig. 2).

Fig. 2A: forte stimolo tattile alla testa evocato una coda-flip controllato dal circuito mediale gigante. Il picco registrato del neurone gigante (asterischi) e la deformazione grande fasica che segue consente l'identificazione non ambigua della coda-flip come mediata da attività neurone gigante. Il movimento all'indietro indicato nella traccia video determina l'identità del circuito neurale attivato (MG).

Fig. 2B: Coda-flip mediata dal circuito gigante laterale dopo un forte stimolo tattile è stato applicato alla coda. Movimento verso l'alto e in avanti si vede nel video tracce insieme alla traccia sincronizzato elettronica visualizzando il gigante e il grande picco, deflessione fasica iniziale determina l'identità del circuito neurale attivato (LG).

Fig. 2C: Coda-flip controllata dal gigante non circuiti. Uno stimolo tattile più graduale è stato consegnato al torace dell'animale. Mentre il movimento catturato in video non consentano l'identificazione univoca del circuito attivato, la registrazione elettronica manca un picco gigante e si compone di deviazioni molto più piccoli che identifica il circuito attivato (non-G).

Fig. 3: misure di latenza per tutti e tre i tipi di fuga coda-flip. Tempo di contatto tra la sonda e la risposta fisiologica è stata misurata per sette animali. Giant-mediata coda ribalta sono suscitato notevolmente più veloce rispetto ai non-gigante coda-flip.

Figura 1: Un esempio per una camera di registrazione utilizzato nei nostri esperimenti per gli animali di 2,5-3,5 cm di lunghezza totale. Gli elettrodi bagno sono incollati ai lati opposti della camera, mentre il filo di terra è collegato al lato lungo della camera e perpendicolare agli elettrodi bagno.

Figura 2: fotogrammi video singolo registrato a 1000 registrazioni f / sec e corrispondente elettronico per tre diversi tipi di stimolazione.

A) Un forte stimolo tattile è stato consegnato alla testa dell'animale e suscitato un gigante mediale (MG) ​​mediata coda-flip. Sei video-frame vengono visualizzate sulla sinistra. Traccia di registrazione dalla sonda utilizzata per toccare l'animale è mostrata in grigio, il punto di contatto è indicato dalla freccia nera. Traccia di registrazione ottenuti con gli elettrodi bagno è mostrata in blu. L'inserto mostra la piccola punta assone gigante che precede le grandi deviazioni fasica. Barre di grigio corrispondono al video-frame mostrato a sinistra. Il primo movimento notevole di coda del gambero è verificato a telaio # 3, sette millesimi di secondo dopo il contatto con la sonda.

B) Un forte stimolo tattile è stato consegnato alla coda dell'animale e suscitato un gigante laterale (LG) mediata coda-flip. Sei video-frame vengono visualizzate sulla sinistra. Traccia di registrazione dalla sonda utilizzata per toccare l'animale è mostrata in grigio, il punto di contatto è indicato dalla freccia nera. Traccia di registrazione ottenuto con laelettrodi bagno è mostrato in rosso. L'inserto mostra la piccola punta assone gigante che precede le grandi deviazioni fasica. Barre di grigio corrispondono al video-frame mostrato a sinistra. Il primo movimento notevole di coda del gambero è verificato a telaio # 3, otto millesimi di secondo dopo il contatto con la sonda.

C) Uno stimolo debole e graduale tattile è stato consegnato alla testa dell'animale e suscitato un non-gigante (Non-G) mediata coda-flip. Otto video-frame vengono visualizzate sulla sinistra. Traccia di registrazione dalla sonda utilizzata per toccare l'animale è mostrata in grigio, il punto di contatto è indicato dalla freccia nera. Traccia di registrazione ottenuti con gli elettrodi bagno appare in bianco. La traccia non ha il potenziale gigante punta, la grande deviazioni iniziale ed è costituito da potenziali di ampiezza molto più piccola. Luce barre grigie corrispondono al video-frame mostrato a sinistra. Il primo movimento notevole di coda del gambero è verificato a telaio # 6, 115 millesimi di secondo dopo il primo contatto con la sonda.

Figura 3: misure di risposta di latenza per sette diversi animali di entrambi i sessi e di dimensioni simili (lunghezza media ± stdv: 3.2 cm ± 0,2 cm, misurati dal rostro fino telson). MG (barra blu) e LG (barra rossa) tail-flip hanno latenze di risposta significativamente più breve di coda-flip mediata dalla non-G (barra nera) circuiti. Medie e deviazioni standard sono mostrati. Bar con la stessa lettera non differiscono significativamente tra loro (rank test Wilcoxon Signed per il confronto a coppie, p <0,05).

Non invasiva registrazioni di attività singolo neurone o l'attivazione del circuito neurale sono difficili da ottenere negli animali sfrenato. Il metodo qui descritto fornisce un mezzo per identificare i pattern di attivazione neurale sottostante naturale comportamento.

In passato, abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per misurare i modelli di attività nei circuiti neurali escape di gamberi giovani durante la formazione di gerarchie di dominanza sociale ^1, durante gli attacchi di predatori naturali ^2, e più recentemente, in risposta alle minacce visive ^3. Attualmente, si usa sincronizzato registrazioni elettrodo bagno e ad alta velocità le registrazioni video per misurare l'importanza dei movimenti di appendici testa durante l'esecuzione di comportamenti di fuga in gamberi.

Mentre questa tecnica è stata utilizzata solo in due diverse specie di invertebrati (gamberi e libellule) e in due laboratori ^4, sembra probabile che possa essere applicato ad altri sistemi modello animale, compresi i vertebrati, alcuni dei quali sono comportamenti acquatici ed esprimere che sono controllati da neuroni di grandi dimensioni. Per esempio, le risposte di fuga veloce di pesci teleostei molti sono controllati da cellule Mauthner, grandi neuroni identificabili ^5. Fuga comportamento mediata dalle cellule Mauthner ha ricevuto molta attenzione nella letteratura ed è stata studiata su più livelli di analisi, ma, vi è una crescente evidenza che le cellule di Mauthner controllo del corpo si trasforma rapidamente in situazioni che non sono correlate a fuggire ^6,7. Le prove, tuttavia, è per lo più derivati ​​dal confronto variabili cinematiche dei comportamenti e non da misure dirette di attività delle cellule di Mauthner. Potrebbe essere possibile utilizzare le registrazioni elettrodo bagno in combinazione con l'alta velocità videografia per misurare le potenzialità campo generato dalle cellule Mauthner o associati l'attività muscolare.

Oltre al suo valore scientifico, la tecnica qui descritta è ideale anche per scopi didattici (ad esempio, laboratori didattici universitari), grazie alla sua semplicità ed economicità complessiva.