Opnamen van Neurale Circuit Activering in vrij Behaving Dieren

Deel 1: Opname kamer

1. De opname van de kamer is rechthoekig van vorm en is gemaakt van dunwandig glas. Kamer afmetingen zijn 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (lengte x breedte x hoogte) voor dieren van 2,5 - 3,5 cm totaal lengte (gemeten vanaf rostrum tot aan telson).
   Zie Fig. 1 voor een voorbeeld van een kamer die in onze experimenten.
2. Als alternatief kan de opname kamers worden gemaakt van andere materialen (bv. niet-toxisch doorzichtig plastic). Chambers kan variëren volgens de experimentele procedure en de kamers moeten worden aangepast voor elke experimentele serie. Voor de beste resultaten, moet kamer zo klein mogelijk zijn zonder beteugeling van de dieren in hun natuurlijke gedrag. Als een vuistregel, moet de lengte en de breedte van de kamer niet meer dan drie keer de grootte van het dier.

Deel 2: Bad elektroden en aarddraad

1. Een paar van de registrerende elektroden en een massa-elektrode worden gebruikt. Elektroden zijn gemaakt van geïsoleerde koperdraad (26 AWG met 0,25 mm isolatie). Het ene uiteinde van het bad elektroden wordt aangesloten op een versterker extracellulaire (AM Systems 1700, zie hieronder) en 0,5 - 1,0 mm van de isolatie zijn ontdaan van de andere eindigt. De grond draad wordt verbonden met de aarde van de versterker of andere geaarde apparatuur en 2-3 cm van de isolatie is ontdaan van de andere kant.
2. Bath elektroden en aarddraad zijn verbonden aan de binnenkant van de opname kamer met niet-giftige lijm. Registrerende elektroden worden centraal gepositioneerd aan beide korte zijden van de kamer en tegenover elkaar (fig. 1).
3. Aardelektrode is gepositioneerd op een lange zijde van de opname kamer loodrecht op de registrerende elektroden (afb. 1).
4. Kamer is gevuld met gedemineraliseerd water. De beste resultaten worden verkregen met water van een hoge weerstand (~ 18 MΩ).

Deel 3: Bad elektrode-opnamen

1. Uitgangen van het opnemen van elektroden worden versterkt (1000x) door een extracellulaire versterker (AM Systems, Model 1700). Signaal van de registrerende elektroden wordt gefilterd met een combinatie van lage frequenties (<100 Hz) en hoge-frequentie cut-offs (> 5 KHz). Signaal wordt vervolgens aangesloten op een schakelkast en een data-acquisitie board (National Instruments). Gedigitaliseerde gegevens wordt opgenomen, opgeslagen en geanalyseerd met behulp van data-acquisitie software (Photron Motion Tools).
2. Als alternatief kan versterkt signaal van de registrerende elektroden worden gedigitaliseerd met behulp van andere analoog-digitaal-omzetters (bijv. MDS Analytical Technologies; Digidata 1440) voor de gedigitaliseerde gegevens worden opgenomen met andere commercieel verkrijgbare data-acquisitie software (bijvoorbeeld MDS Analytical Technologies; Axoscope).

Deel 4: Stimuleren probe

1. Een stimulerende sonde is gemaakt van een glazen pipet (14 cm lang) zijn uitgerust met een paar fijne draad elektroden. Elektrode tips worden blootgesteld (0,2 mm) om een ​​elektronisch signaal als het dier wordt aangeraakt door de sonde te produceren. Dit maakt het meten van de exacte tijd van de stimulatie.
2. Uitgangen van het stimuleren van sonde worden versterkt (1000x) door een extracellulaire versterker (AM Systems, Model 1700). Het signaal wordt gefilterd met een combinatie van lage frequenties (<100 Hz) en hoge-frequentie cut-offs (> 5 KHz). Het signaal wordt vervolgens aangesloten op een schakelkast en een data-acquisitie board (National Instruments). Gedigitaliseerde gegevens wordt opgenomen, opgeslagen en geanalyseerd met behulp van data-acquisitie software (Photron Motion Tools).

Deel 5: Video-opnamen

1. Een high-speed video camera (Fastcam-X 1280 PCI, Photron) is loodrecht op de opname kamer naar een zij-aanzicht te geven. Niveau van helderheid in de opname kamer moet worden aangepast om de beste resultaten, bijvoorbeeld door middel van een zwanenhals verlichting of andere lichtbronnen focusseerbaar te bieden.
2. High-speed videografie wordt gecombineerd en gesynchroniseerd met elektronische opnamen met behulp van een breakout-box en data acquisitie board (National Instruments). Versterkt het signaal van de elektroden bad is aangesloten op de breakout-box en data-acquisitie board met behulp van BNC kabels. Een externe hand-Schakelschuif start de gesynchroniseerde video-en data-acquisitie.

Deel 6: Experimentele procedure

1. Een enkel dier wordt geïntroduceerd in de kamer en liet om te acclimatiseren gedurende 5 minuten. Escape tail-flips worden opgewekt door enkele kranen van verschillende intensiteit aan het hoofd of de buik, respectievelijk. De intensiteit van de kranen wordt gecontroleerd door de experimentator. Elke ontsnapping staart-flip is opgenomen met high-speed video met een framerate van 1000 f / sec, en data punten van elektronische veld potentialen worden opgenomen bij 25 kHz. Start van de bad-en video-opname wordt geïnitieerd door handschakelaar aan een trigger box. Opnameduur wordt bepaald door de gekozen frame rate (bv, 1000 f / sec = 4 sec totale opnametijd). Post-en pre-trigger opnametijden kunnen worden geselecteerd.
2. Niete: Bad elektrode-opnames moet een keer worden gecontroleerd voor elke geteste soort door de combinatie van bad elektrode opnamen met andere beschikbare opnames methoden. In rivierkreeft, kan een paar zilveren elektroden operatief worden geïmplanteerd rondom de ventrale zenuw koord. Stimuli uitlokken ontsnappen tail-salto's kunnen worden toegepast en vastgelegd elektronische sporen van geïmplanteerde elektroden en bad kunnen worden vergeleken.
3. Escape tail-flip gedrag en de bijbehorende neurale activiteit kan worden opgenomen in een verscheidenheid van verschillende contexten, bijvoorbeeld in reactie op visuele bedreigingen, tijdens het roofdier aanvallen, of tijdens de agonistische ontmoetingen van twee rivierkreeft. Kamer grootte, opnamemodus, enz., dienovereenkomstig worden aangepast (zie Discussie).

Deel 7: Data-analyse

1. Enkele video frames zijn geanalyseerd met behulp van motion gereedschap software (Photron). Elektronische sporen worden gebruikt om het type van neurale circuit dat werd geactiveerd door elke stimulus te identificeren. Video data wordt vergeleken met gesynchroniseerd fysiologische opnames om de beweging van het dier en de geactiveerde neurale circuit te bepalen. Elke geactiveerd circuit produceert een karakteristieke elektronische handtekening (zie Vertegenwoordiger resultaten).
2. Latency tussen de sonde contact en neurale / spierreactie worden berekend voor elk experiment door het meten van de vertraging tussen het begin van de sonde signaal en het begin van het signaal opgenomen met het bad elektroden.

Deel 8: Representatieve resultaten

Een reeks van enkele high-speed video-frames en de bijbehorende elektrische veld-opnames om te ontsnappen staart-flip in antwoord op een tactiele stimulus geleverd aan de kop of de staart van een jonge rivierkreeft (afb. 2).

Fig. 2A: Sterke tactiele stimulus aan het hoofd opgeroepen een staart-flip gecontroleerd door de mediale grote circuit. De opgenomen spike van de reus neuron (sterretjes) en de grote fasisch afbuiging dat volgt maakt niet-ambigue identificatie van de staart-flip zoals gemedieerd door reusachtige neuron activiteit. De achterwaartse beweging in de video-sporen is bepalend voor de identiteit van de geactiveerde neurale circuit (MG).

Fig. 2B: Staart-flip gemedieerd door de laterale gigant circuit na een sterke tactiele stimulus werd toegepast op de staart. Opwaartse en voorwaartse beweging zien in de video sporen, samen met de gesynchroniseerde elektronische trace de weergave van de gigantische piek en de grote, fasisch eerste afbuiging is bepalend voor de identiteit van de geactiveerde neurale circuit (LG).

Fig. 2C: Staart-flip gecontroleerd door niet-gigant circuit. Een meer geleidelijke tactiele stimulus werd geleverd aan de thorax van het dier. Terwijl de beweging vastgelegd op video staat niet toe dat ondubbelzinnige identificatie van de geactiveerde circuit, de elektronische registratie ontbreekt een gigantische piek en bestaat uit veel kleinere doorbuigingen het identificeren van de geactiveerde circuit (Non-G).

Fig. 3: Latency metingen voor alle drie typen te ontsnappen tail-flips. Tijd tussen sonde contact en fysiologische respons werd gemeten voor zeven dieren. Giant-gemedieerde tail-flips zijn aanzienlijk uitgelokt sneller dan niet-gigant tail-flips.

Figuur 1: Een voorbeeld van een opname kamer gebruikt in onze experimenten voor dieren van 2.5-3.5 cm in totaal lengtes. Het bad elektroden zijn vastgelijmd aan tegenovergestelde zijden van de kamer, terwijl de aardedraad is bevestigd aan de lange zijde van de kamer en loodrecht op het bad elektroden.

Figuur 2: Enkele video beelden opgenomen met 1000 f / sec en de bijbehorende elektronische opnamen voor drie verschillende types van stimulatie.

A) Een sterke tactiele stimulus werd geleverd aan de kop van het dier en ontlokte een mediale reus (MG) ​​gemedieerde staart-flip. Zes video-frames worden weergegeven aan de linkerkant. Het opnemen van sporen van de sonde wordt gebruikt om de dieren aanraken wordt weergegeven in het grijs, het aanspreekpunt wordt aangegeven door de zwarte pijlpunt. Opname trace verkregen met het bad elektroden wordt weergegeven in blauw. De inzet toont de kleine reus axon piek die de grote fasisch doorbuigingen voorafgaat. Grijze balken komen overeen met de video-frames aan de linkerkant. De eerste opvallende beweging van de staart van de rivierkreeft's traden op bij frame # 3, zeven milliseconden na het contact met de sonde.

B) Een sterke tactiele stimulus werd geleverd aan de staart van het dier en ontlokte een laterale reus (LG) gemedieerde staart-flip. Zes video-frames worden weergegeven aan de linkerkant. Het opnemen van sporen van de sonde wordt gebruikt om de dieren aanraken wordt weergegeven in het grijs, het aanspreekpunt wordt aangegeven door de zwarte pijlpunt. Opname trace verkregen met debad elektroden wordt getoond in het rood. De inzet toont de kleine reus axon piek die de grote fasisch doorbuigingen voorafgaat. Grijze balken komen overeen met de video-frames aan de linkerkant. De eerste opvallende beweging van de staart van de rivierkreeft's traden op bij frame # 3, acht milliseconden na het contact met de sonde.

C) Een zwakke en geleidelijke tactiele stimulus werd geleverd aan de kop van het dier en ontlokte een niet-reus (Non-G) gemedieerde staart-flip. Acht video-frames worden weergegeven aan de linkerkant. Het opnemen van sporen van de sonde wordt gebruikt om de dieren aanraken wordt weergegeven in het grijs, het aanspreekpunt wordt aangegeven door de zwarte pijlpunt. Opname trace verkregen met het bad elektroden wordt weergegeven in zwart. Het spoor heeft niet de gigantische piek potentieel, de grote initiële vervormingen en bestaat uit mogelijkheden van veel kleinere amplitude. Licht grijze balken komen overeen met de video-frames aan de linkerkant. De eerste opvallende beweging van de staart van de rivierkreeft's traden op bij frame # 6, 115 milliseconden na het eerste contact met de sonde.

Figuur 3: Response latency metingen voor zeven verschillende dieren van beide geslachten en soortgelijke maten (gemiddelde lengte ± stdv: 3,2 cm ± 0,2 cm, gemeten vanaf rostrum tot aan telson). MG (blauwe balk) en LG (rode balk) staart-salto's zijn aanzienlijk korter dan de staart reactie latency-flips gemedieerd door niet-G (zwarte balk) circuit. Gemiddelden en standaarddeviaties worden weergegeven. Bars met dezelfde letter niet significant van elkaar verschillen (Wilcoxon Signed Rank test voor paarsgewijs vergeleken, p <0,05).

Niet-invasieve opnames van enkel neuron activiteit of neurale circuit activering zijn moeilijk te verkrijgen in ongebreidelde dieren. De hier beschreven methode een middel om patronen van neurale activatie onderliggende natuurlijke gedrag te identificeren.

In het verleden hebben we met succes gebruikt deze techniek om patronen van activiteit meten in neurale circuits ontsnapping van jeugdige rivierkreeft tijdens de vorming van sociale dominantie hiërarchieën ^1, tijdens de aanvallen van natuurlijke vijanden ^2, en meer recent, in reactie op visuele bedreigingen ^3. Op dit moment maken we gebruik van gesynchroniseerde bad elektrode opnamen en high-speed video-opnames om het belang van de bewegingen van het hoofd van appendages te meten tijdens de uitvoering van de vlucht gedrag in rivierkreeft.

Hoewel deze techniek alleen gebruikt in twee verschillende ongewervelde soorten (rivierkreeft en libellen) en in twee verschillende laboratoria ^4, lijkt het waarschijnlijk dat het kan worden toegepast op andere diermodel, waaronder gewervelde dieren, waarvan sommige in het water levende en express gedragingen die worden gecontroleerd door grote neuronen. Bijvoorbeeld, zijn snel te ontsnappen reacties van vele teleost vissen gecontroleerd door Mauthner cellen, grote herkenbare neuronen ^5. Escape gedrag gemedieerd wordt door de Mauthner cellen heeft veel aandacht gekregen in de literatuur en is onderzocht op verschillende niveaus van analyse, maar toch, er is steeds meer aanwijzingen dat Mauthner cellen snelle lichaam draait controle in situaties die niet gerelateerd zijn aan ^6,7 ontsnappen. Het bewijs is echter meestal afgeleid van het vergelijken van kinematische variabelen van het gedrag en niet van directe metingen van Mauthner cel activiteit. Het kan mogelijk om bad elektrode-opnamen te gebruiken in combinatie met een high-speed videografie naar veld potentialen gegenereerd door de Mauthner cellen of bijbehorende spieractiviteit te meten.

Naast de wetenschappelijke waarde, de techniek hier beschreven is ook uitermate geschikt voor educatieve doeleinden (bv. undergraduate onderwijs laboratoria) te wijten aan de algemene eenvoud en inexpensiveness.