Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

Voorbereiding voor dissectie

Chirurgische instrumenten: steriliseren alle dissectie schaar en pincet door de autoclaaf

Dekglaasje reiniging:

1. Geniet van alle dekglaasjes (15 mm in diameter voor de 24-wells plaat) in 1L gras beker in 33% HCl voor minimaal 24 uur
2. Wassen met stromend water gedurende 10 minuten met af en toe te schudden alle overblijvende HCl te verwijderen
3. Spoelen met Millipore water
4. Drainwater uit
5. Geniet van coverslips in 95-98% ethanol
6. Overdracht coverslips een schone tissue op een vlakke plaat en de lucht droog de dekglaasjes
7. Overdracht coverslips naar een glazen beker, dek af met aluminiumfolie en autoclaaf
   Opmerking: Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in dit stadium
8. Plaats individuele dekglaasje in de cultuur platen. Klaar voor het coaten

Dekglaasje coating:

1. Verdun 100 x voorraad van poly-D-lysine (PDL, 10 mg / ml in 0,5% bovine serum albumine in PBS, opgeslagen als fracties bij -20 ° C) met PBS en filter-gesteriliseerd (0,22 pm)
2. Coat coverslips met 1 x PDL-oplossing (~ 0,15 ml / cm ²⁾ gedurende 2 uur bij 37 ° C in een incubator
3. Verwijder de PDL oplossing weg en was 3 keer met steriele DDH ₂ O en droog coverslips volledig

Let op: Coat genoeg dekglaasjes / platen voor elke dissectie. PDL-gecoate dekglaasjes kunnen worden opgeslagen voor een paar weken bij 4 ° C.

Media en oplossingen

Dissectie medium (DM): Gebruik Balanced Salt steriele ijskoud Hank's Solution (w / o Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} (HBSS, Invitrogen 14175), aangevuld met 10 mM HEPES (Invitrogen 15630).

Aggregate cultuur media: De DMEM/NBB27 medium bevat DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM natrium pyruvaat, 0.75mm Glutamax, 60μg/ml N-acetylcysteïne, 5 ng / ml insuline, 10nm d-biotine en 1% penicilline / streptomycine. Om 100 ml van de totale cultuur medium, mix 50 ml DMEM (w / o pyruvaat / glutamine, Invitrogen 11960), 50 ml Neurobasal medium (Invitrogen 211.034), 375 pl Glutamax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg natrium pyruvaat (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17.504), 6,3 mg N-acetylcysteïne (Sigma A8199), 1 ml op voorraad Sato (100 x voorraad, zie hieronder), 25 ul van d-biotine voorraad (4000 x voorraad, 40 uM in PBS opgeslagen als fracties bij -20 ° C. Sigma B4639), 100 ul van insuline (1000 x voorraad, 5 mg / ml in 0,01 N HCl opgeslagen als fracties bij -20 ° C, Sigma 16.634), en 1 ml penicilline / streptomycine (100 x voorraad, Invitrogen 15.140), filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C.

Sato 100 x stamoplossing: Om 40 ml van de voorraad te maken: meng 40 ml Neurobasal met 400 mg apo-transferrine (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 ul van progesteron (25 mg / ml ethanol, opgeslagen als fracties bij -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescine (Sigma P7505) en 40 pi van natrium seleniet (30 uM in PBS, opgeslagen als fracties bij -20 ° C, Sigma S5261). Filter steriliseren van de Sato voorraad oplossing, en op te slaan als fracties bij -20 ° C.

Neuron plating medium (PM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2 mM glutamine (100x voorraad, porties bewaard bij -20 ° C, Invitrogen 25.030), 25μM glutaminezuur (100 aandelen, porties bewaard bij -20 ° C) en 1% penicilline / streptomycine.

Neuron kweekmedium (CM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2 mM glutamine (100x voorraad, porties bewaard bij -20 ° C) en 1% penicilline / streptomycine.

5-FDU voorraad: 100x voorraad, 1 mM 5-fluoro-2'-deoxyuridine (Sigma F0503) and1mM uridine (Sigma U3003) in Neurobasal medium. Filter gesteriliseerd en opgeslagen als fracties bij -20 ° C.

Papaïne spijsvertering oplossing (het maken van verse voorafgaand aan de dissectie):

1. Los 3,2 mg L-Cysteïne (Sigma C-7352) in 4 ml DM
2. Breng de pH tot circa 7,4 met 1 N NaOH (pH-test op teststrips) en plaats in een waterbad bij 37 ° C
   Let op: Voer de volgende stap recht voor weefsel spijsvertering (zie hieronder).
3. Voeg papaïne tot een uiteindelijke concentratie van 20 eenheden / ml
4. Filter steriliseren (0.22mm), en plaats in een waterbad bij 37 ° C

Trypsine-remmer oplossing (het maken van verse voorafgaand aan de dissectie):

1. Los 0,2 g trypsine-remmer (Sigma T7295) in 20 ml DM
2. Controleer de pH en de pH instellen op ~ 7,4 met 1 N NaOH
3. Filter steriliseren, en plaats in een waterbad bij 37 ° C

Brain Dissection

Setup:

• Gesteriliseerd pincet en schaar
• 70% ethanol
• Schone tissue papier en DIAPER pad op de bank
• 10cm petrischalen met ijs-koud DM voor de baarmoeder en de foetus op de bank
• Ijs platform op dissectie microscoop
• 2-3 6cm gerechten met DM op het ijs
• Warm PM in een 37 ° C waterbad

1. Euthanaseren een zwangere Sprague-Dawley rat (E16), volgens een procedure goedgekeurd door uw Institutional Animal Care en ons Comite (IACUC)
2. Leg de rat op de luier pad en sterilisatie alcohol op de buikstreek
3. Gebruik een pincet om de buikhuid en een schaar te houden om een ​​V-vorm incisie te snijden alleen de huid
4. Uit elkaar de huid en gebruik een ander gesteriliseerd pincet en een schaar te snijden door de spierlaag
5. Pak de keten van de embryo zakken en breng ze in een 10 cm schotel met ijskoud DM
6. Met behulp van een schaar microdissection, verwijder voorzichtig elk embryo uit de zak en de hersenen van elk embryo, en plaats bevrijd hersenen in een schoon 10cm schotel met DM op een ijs-platform
7. In een Laminar motorkap en onder een microscoop dissectie, verwijder dan middenhersenen / achterhersenen secties, en gebruik fijne tang om hersenvliezen te verwijderen, en de overdracht van de gereinigde cortex / hippocampus aan een nieuwe 6 cm schotel met DM op een ice-pack
   Let op: in dit stadium, het weefsel is klaar voor enzymdigestie.
8. Maak papaïne en trypsine-remmer oplossing en filter steriliseren
9. Verwijder overtollige DM uit cortices / hippocampus
10. Voeg 4 ml van de bereide papaïne spijsvertering oplossing
11. Breng alle inhoud naar een 50 ml buis en de Falcon buis in een waterbad plaats bij 37 ° C gedurende precies 5 minuten
12. Verwijder papaïne oplossing met pipet
13. Voeg 5 ml trypsine-remmer oplossing, draai de buis, en plaats in een waterbad bij 37 ° C gedurende 2-3 min
14. Verwijder de trypsine-remmer oplossing
15. Herhaal stap 13 en 14 drie keer
16. Voeg 20ml warm PM
17. Vermaal totdat alle klonten zijn verdwenen (~ 20-30 keer)
18. Centrifugeer bij 100xg voor 7min
19. Resuspendeer de pellet in 10 ml PM en was twee keer door middel van centrifugeren
20. Resuspendeer de pellet in 10 ml PM voor reguliere neuron culturen of in NBB27/DMEM voor gezamenlijk culturen
21. Passeren de cellen door middel van een 70μm cel zeven
22. Count levende cellen
23. Ga verder naar de totale culturen, zoals hieronder beschreven of het bord van de cellen voor de reguliere neuron culturen
    Let op: Bij deze stap, hoogverrijkt neuron culturen kan worden bereikt door uitplating de gedissocieerde cellen op PDL-coating platen op dichtheid van 200 tot 640 cellen / mm ² afhankelijk van het doel van de experimenten. Na de cellen hebben bevestigd (~ 2-4h), vervangen door medium met warm PM. Als kweken voor langere tijd, op dag 4, vervangt u de helft van het medium met warme CM. Voor zeer gezuiverde neuronale culturen, mitotische inhibitor 5-FDU (eindconcentratie 10 uM) kunnen worden toegevoegd aan DIV2 aan niet-neuronale celproliferatie te remmen (dat wil zeggen, tijdens DIV2-3). Na herstel in CM voor 2 dagen worden de cellen pols opnieuw behandeld met 5-FDU nog 2 dagen (DIV 6-7), gevolgd door een volledig medium te veranderen. Daarna vervang de helft van het medium met verse, warme CM om de 3-4 dagen. Neuronen zijn haalbaar voor maximaal 4 weken.

Aggregaten voorbereiding en plating

1. Suspend gedissocieerde cellen in NBB27/DMEM medium dat 1x Sato, 10ng/ml CNTF en 10μM forskoline bij een dichtheid van 2x10 ⁶ cellen / ml
2. Overdracht 2 ml celsuspensie in elk putje van een ongecoate 6-wells plaat
3. Cultuur voor 3 nachten. Elke dag, zachtjes resuspendeer de cellen een keer met behulp van een P1000 Pipetman
   Noot: Cellen begin tot aggregaten (figuur 1) te vormen.
4. Op de dag voor aggregaat plating, coat plaat / dekglaasjes met Matrigel:
   • Verdunnen voorraad Matrigel (groeifactor gereduceerd, BD Biosciences 354230) 1:20 met koud DMEM op het ijs
     Let op: Matrigel aliquots moeten bereid zijn per fabrikant protocol. Alle tips, moet Eppendorf buizen en oplossingen voor het maken van fracties van de voorraad worden koud om Matrigel polymerisatie te voorkomen. Hoeveelheden van Matrigel worden bewaard bij -80 ° C en ontdooid bij 4 ° C.
   • Coat eerder PDL-beklede dekglaasjes met 300μl/well van de verdunde oplossing Matrigel 's nachts in een 37 ° C incubator
   • Wassen met warm PBS, daarna wassen plaat met warm steriele DDH ₂ O en laat de platen in de incubator.
5. 3 dagen na de totale formatie, opnieuw voorzichtig resuspendeer cellen en zeef de suspensie door middel van een 200μm maas in een 50 ml Falcon buis. Laat aggregaten naar de bodem van de buis af te wikkelen door de zwaartekracht (~ 3-5min)
6. Verwijder voorzichtig supernatant
7. Voeg medium, zacht resuspendeer de aggregaten en laat ze weer af te wikkelen. Herhaal deze procedure een paar keer om de dode cellen, individuele cellen en vuil te verwijderen. Gebruik microscoop om te controleren of het supernatant nog niet-geaggregeerde cellen en debri bevattens
8. Voorzichtig resuspendeer de aggregaten in dezelfde NBB27/DMEM medium (figuur 1) en tel aggregaten
9. Pas de dichtheid van de aggregaten naar ongeveer 25-30 aggreggats/50ul
10. Transfer porties (500-1000μl) van de totale suspensie 2 ml Eppendorf buizen voor plating
    Opmerking: Aangezien aggregaten hebben de neiging om neer te strijken op de bodem van de buizen, is het cruciaal om meerdere buizen van de totale ophanging te maken voor plating. Voorzichtig resuspendeer de aggregaten vaak nog voordat het zaaien ze op beklede dekglaasjes of cultuur platen vergelijkbaar aantal aggregaten uitgeplaat op elk dekglaasje te verzekeren.
11. Haal de cultuur plaat met Matrigel-gecoate dekglaasjes van incubator. Verwijder de oplossing van elk putje, was de dekglaasjes met warme PBS en DDH ₂ O, en dan droog kort. Ze zijn nu klaar voor de totale zaaien
12. Omgekeerde een buis met aggregaat schorsing zodat ze gelijkmatig worden verdeeld voordat zaaien. Belasting 50μl van de totale suspensie in het midden van elke dekglaasje, en voorzichtig weer de plaat incubator zonder verdere verstoring te laten aggregaten gelijkmatig hechten aan de dekglaasje
    Opmerking: De dichtheid van aggregaten is van cruciaal belang. Als aggregaten zijn gezaaid te dicht bij elkaar of als het zaaien dichtheid is hoog, ze lijken over te gaan samen als ze groeien.
13. Voeg extra DMEM/NBB27medium (500 pl) aan elke well 4-6 uur later of vroeg de volgende ochtend
14. Handhaving van de totale cultuur, half verandering het medium om de 3-4 dagen. Bij het veranderen medium, wees niet te verstoren en de aggregaten dit wordt gedaan door voorzichtig toe te voegen medium langs de zijwand van de put.
    Let op: Enkele uren na de aggregaten aan de plaat, neurietuitgroei van de aggregaten kunnen worden waargenomen. Axonen groeien snel in de eerste twee weken en vormen overvloedig verbindingen tussen aggregaten (figuur 2). Gliale voorouders radiaal migreren uit de aggregaten en differentiëren loop van de tijd in de astrocyten en volwassen oligodendrocyten.

Figuur 1. Fase contrastrijke beelden van cellen vormen van aggregaten bij verschillende dag-en aggregaten na het wassen.

Figuur 2. Fase contrastrijke beelden van een aggregaat cultuur 2 en 12 dagen na gezaaid op Matrigel-gecoate dekglaasjes.

Vroege studies de vorming van synapsen en volwassen myeline in rotatie-gemedieerde vrij zwevende aggregaat culturen ^1. De CNS totale cultuur beschreven systeem hier een combinatie van serum-vrij groei van multipotente progenitorcellen in drie dimensionale aggregaten met het gemak van de traditionele 2D-culturen om analyses van cel-ontwikkeling, migratie en differentiatie in vitro te vergemakkelijken. Het systeem kan worden aangepast en gebruikt voor neurale voorloper cel-onderzoek en voor onderzoek naar neuron-glia interacties. Bijvoorbeeld, genetisch gemodificeerde cellen, zoals oligodendrocyt voorouders ² kan worden toegevoegd aan de totale culturen. Effect van immuuncellen zoals macrofagen en microglia of verschillende reagentia op de ontwikkeling en differentiatie van neuronen en glia kunnen ook worden bestudeerd. Reaggregates van gezuiverde retinale ganglioncellen zijn onlangs gebruikt om de CNS myelinisatie studeren in cocultures met oligodendrocyten in afwezigheid van andere cellen ^3. In overeenstemming met vorige verslag ^4, Matrigel lijkt superieur te zijn aan PDL in die zin dat celadhesie stimuleert en versnelt neurietuitgroei en glia differentiatie. Matrigel wordt daarom gebruikt als substraat voor de cel aggregaten in dit protocol.