הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

חלק 1: Dissection ו-Cell בידוד דו קוטבית

1. הכינו פתרונות המפורטים בטבלה 2, ה-pH של האצבעות "(חיצוני) הפתרונות צריכים להיות מותאמים 7.4 עם NaOH ו-pH של התמיסה הפנימית צריך להיות מותאם עם 7.2 CsOH. הגן על פתרון פנימי מן האור עם רדיד אלומיניום ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש;
2. Dark-להסתגל דג זהב במשך 30 דקות לפחות לפני החיתוך;
3. בעוד החיה כהה מתאים, להכין 5 מ"ל של hyaluronidase (hyaluronidase סוג V, 1100 יחידות / מ"ל Ca נמוך ^{2 +} הצלצול של: סיגמא, סנט לואיס, מיזורי) ו - 10 מ"ל של ציסטאין-L (0.5 מ"ג / מ"ל ב Ca נמוך ^{2 +)} של הצלצול פתרונות ולשקול את papain (אבקת lyophilized, 40 יחידות / מ"ל; סיגמא, סנט לואיס, מיזורי) עבור 5 מ"ל של הפתרון לעיכול;
4. להרדים את דגי זהב על ידי עריפת ראש מהיר במספריים כירורגית להרוס את המוח ואת חוט השדרה עם להב # 11 אזמל;
5. הסר את העיניים על ידי השמדת חוץ עינית השרירים בעזרת מלקחיים # 7 מעוקל דומון חיתוך עצב הראייה עם איריס מספריים;
6. מקום אחד עין נורה על פיסת נייר לנקב לסנן את לימבוס scleral עם קצה להב # 11 אזמל;
7. הציגו את הלהב של זוג מספריים vannas בתוך השלם ניקב וחתך את פלח קדמי שלם משם;
8. מניחים פיסת נייר קטנה לסנן על גבי כוס הראייה שנותרו להפעיל לחץ מסוים על מנת לקבל הנייר סופג בהומור זגוגי;
9. הרם את נייר הסינון עם הרשתית מחוברים זה וחתך את עצב הראייה עם נקוב של vannas מספריים;
10. הנח את הנייר מסנן המכיל את הרשתית בתוך צלחת פלסטיק 35 מ"מ תרבות עם פתרון לקלף hyaluronidase לסירוגין הרשתית מהעיתון לסנן בעזרת # 7 דומון פינצטה;
11. חותכים את הרשתית תוך 4-6 חתיכות עם חצי תעשייתי להב פלדה יחיד פיפיות פחמן ולתת לו לשבת בפתרון hyaluronidase במשך 20 דקות;
12. בזמן ההמתנה hyaluronidase ייכנסו לתוקף, מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת L-ציסטאין כדי papain ולתת לו לשבת עד הנוזל הופך שקוף (50-10 דקות בערך);
13. לשטוף את החלקים של הרשתית 3x נמוך Ca ^{2 +} Ringer של ולאפשר להם לשבת הפתרון papain עבור 30-35 דקות;
14. לשטוף את החלקים של הרשתית 3x נמוך Ca ^{2 +} Ringer של ולאחסן אותם עד לשימוש ב 4 ° C בצלחת 35 מ"מ תרבות פלסטיק המכילה Ca ^{2 +} נמוך של רינגר;
15. כדי לנתק את התאים, לשים חתיכת הרשתית בצינור microcentrifuge המכיל 500 מ"ל נמוך Ca ^{2 +} הצלצול של לאט triturate הרשתית על ידי pipetting אותה למעלה ולמטה עם דיסוציאציה זכוכית פיפטה, בזהירות לא לייצר כל בועות האוויר. Pipettes דיסוציאציה מיוצרים על ידי חימום קצה פיפטה פסטר זכוכית עם מבער בונזן מעט לכופף אותה בעזרת מלקחיים אנטומי;
16. פלייט תאים מבודדים על ידי הוספת ירידה של ההשעיה רשתית לחדר תוצרת בית הקלטה מלאה בעבר עם 2 מ"ל של Ca ^{2 +} נמוך הצלצול של. תא מורכב בחצי התחתון של צלחת בגודל 35 מ"מ תרבות הפלסטיק עם כל מעגלי באמצע coverslip מעגלי זכוכית 1.78 השבירה המדד (PlanOptik, גרמניה) מודבק לתחתית עם אלסטומר סיליקון (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI).

חלק 2: Loading דו קוטבית תא לשטוף

TIRF הדמיה של שלפוחית ​​סינפטית מתבצעת הטוב ביותר באמצעות מיקרוסקופ אובייקטיבית מסוג TIRFM עם מטרה NA גבוהה מאוד מצלמה רגישה. בניסויים שלנו, אנו בוחרים להשתמש 1.65 NA אובייקטיבי (Apo x100 O HR, 1.65 NA, אולימפוס, יפן) עם EMCCD (אשד 512B, רופר מדעי, טוסון, אריזונה). השימוש המטרה NA גבוה מאוד מחייב שימוש גבוה זכוכית coverslips השבירה נוזל טבילה (di-iodomethane עם גופרית). בתנאים שלנו, אור עירור מוגבל לשדה מתפורר אקספוננציאלית עם אורך קבוע של כ -50 ננומטר.

1. הוסף טיפה של נוזל מדד גבוה השבירה (M הסדרה, מקדם השבירה = 1.7800, Cargille Labs, סידר גרוב, ניו ג'רזי) למטרה מיקרוסקופ;
2. הנח את תא הקלטת בזהירות על גבי המטרה מיקרוסקופ ובזהירות הר אלקטרודה לקרקע ולצאת superfusion הצינור לתא;
3. בואו קאמרית לשבת על מיקרוסקופ עבור 10-20 דקות על מנת לאפשר לתאים כיור לדבוק לתחתית;
4. בינתיים, מכינים 5 מ"ל של trolox 1mm ® ((±)- 6-hydroxy-2-,5,7,8 tetramethylchromane-2-carboxylic חומצה, Sigma, סנט לואיס, מיזורי) פתרון גבוה K ⁺ הצלצול של . Sonicate עד מומס;
5. הכן 15 מ"ל של תמיסת ADVASEP-7 כביסה: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) נמוך ב Ca ^{2 +} הצלצול של. שים לב ADVASEP-7 להשתמש אופציונלית, ניתן להשמיט אם רוצים;
6. הטיהור li superfusionנס ולהוסיף פתרון ADVASEP-7 כביסה, Ca ^{2 +} הצלצול נמוכה של שליטה הצלצול של המערכת superfusion;
7. משוך טעינת pipettes מ דק דופן בורוסיליקט זכוכית (Kwik-פיל ® TW150-3: WPI, סרסוטה, פלורידה). פף התנגדויות פיפטה הם בטווח MΩ 1.5-2.5;
8. הכן את FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) pyridinium, dibromide "אריזה מיוחדת"; Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) פתרונות. ראשית, להפוך את המניה 1 mM 160 על ידי הוספת מים מזוקקים μL כדי בקבוקון אחד (100 מ"ג) של FM1-43 ®. מלאי זה יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. לאחר מכן יש להוסיף 5 μL של FM1-43 ® ל 1 מ"ל גבוהה K ^{+ +} הצלצול של 1mm trolox ®. הגן על פתרון מן האור עם רדיד אלומיניום ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש;
9. כבה את האור הבהיר מיקרוסקופ שדה ולחפש שלם תאים דו קוטבית. מעט הברז מיקרוסקופ כדי לוודא את הנוירונים מחוברים היטב לתחתית של החדר;
10. מקם את העט superfusion קרוב לתא עניין ברציפות perfuse ההכנה עם Ca נמוך ^{2 +} הצלצול של;
11. כבו את האורות בחדר ולהוסיף לעבור אדום לסנן ארוך (כלומר RG630, שוט, גרמניה) לדרך אופטיים כדי למזער עירור של צבע ה-FM;
12. מלאו פיפטה העמסה עם μL 10 הפתרון לצבוע FM, הר פיפטה ב micromanipulator ולהפחית את פיפטה על הכנת ללא overpressure עד שהוא על המטוס מוקד זהה לתא דו קוטבית אתה רוצה לטעון. ודא שיש לך לפחות שני מחזיקי אלקטרודה: אחד המשמש צבע ה-FM לא ניתן להשתמש בו עבור תיקון clamping, אחרת זה עלול לזהם את הפתרון תאיים;
13. עמדת הפתיחה המשאף במרחק של כ -10 מיקרומטר מסוף האקסון, להפוך את מערכת superfusion לסירוגין לנפח את הפתרון לצבוע במשך 10 שניות על ידי סיבוב overpressure פיפטה על;
14. סובבו את overpressure לסירוגין, מבלי להזיז את פיפטה, לחכות 30 שניות;
15. סובבו את superfusion על ורחץ את תא בתמיסה ADVASEP-7 במשך 5 דקות. בינתיים, להסיר את פיפטה המשאף מן הרחצה;
16. אחרי 5 דקות, לעבור Ca נמוך ^{2 +} הצלצול של ו perfuse הקאמרית של 25-30 דקות, כדי לאפשר הסרה של עודפי צבע.

חלק 3: תיקון Clamping ו TIRFM הדמיה

1. למרות ההכנה היא כביסה בחוץ, למשוך pipettes תיקון מן הכוס בורוסיליקט עבה חומה (B150-86-10; החברה סאטר Instrument, Novato, CA). תיקון התנגדויות פיפטה הם בטווח MΩ 8-10;
2. לאחר לשטוף הושלמה, במקום בטרמינל האקסון במרכז שדה הראייה;
3. מלאו פיפטה תיקון עם 7μL של פתרון פנימי, הקש על פיפטה להיפטר בועות אוויר, המעיל פיפטה עם שעווה מותכת שיניים (שעווה דביק; קר Corporation, Orange, CA) ואת הר אותו micromanipulator;
4. סובבו את overpressure פיפטה על ולהפחית את פיפטה לאט על ההכנה. בדוק התנגדות פיפטה של ​​המגבר ו offsets פיפטה נכונה קיבול עם מגבר שולט בהתאמה;
5. כבה את superfusion לשלוט הצלצול של. כדי ליצור gigaseal בין פיפטה ואת התא, מעט מגע קצה האלקטרודה כנגד גוף התא ולהפוך את overpressure פיפטה את בעדינות תוך הפעלת לחץ שלילי על האלקטרודה;
6. אמנם חתום, לבחור במצב "כל תא" בתוך המגבר ולהגדיר את תא המעצר פוטנציאל mV -60;
7. בחר אזור עניין עם תוכנת הדמיה שכולל את הטרמינל האקסון כולו, להדליק את האור בשדה בהיר לסירוגין, על ידי חשיפה קצרה (30 מילישניות) מסוף לייזר 488 ננומטר, למצוא את מישור המוקד הנכון TIRF הדמיה;
8. שוברים לתוך התא באמצעות "zap" הפקודה של המגבר תוך הפעלת לחץ שלילי במקצת פיפטה;
9. נכון עבור קיבול התא התנגדות הסדרה, ולאחר מכן להחיל את פרוטוקול מתח הריבית בעוד התנועה הדמיה של שלפוחית ​​סינפטית. זהו בשלב זה חשוב לקבל את פרוטוקול מתח מסונכרן מסגרת הדולר מצלמה. במקרה שלנו, כל מסגרת 30 ms זמן רב, ולכן השינויים מתרחשים מתח בכפולות של ערך זה (כלומר, כל 300 ms או 10 מסגרות);
10. חכו לפחות 40 שניות בין ניסויים על מנת לאפשר התאוששות;
11. כדי לבדוק את המיקום של סרטים הסינפטי, לצלם תוך כדי סיבוב לייזר 561 ננומטר ב.

איור 1: הגדרת הניסוי. 488 ננומטר לייזר (כחול) מתמקדת לפריפריה של המטוס בחזרה מוקד המטרה וסובל השתקפות פנימית מוחלטת כאשר הוא מגיע זכוכית מימית ממשק בינוני. השדה האלקטרומגנטי שנוצר על ידי קרן שיקף מלהיב את fluorophore נטען לתוך שלפוחית ​​סינפטית הקרובים בוטאום של חדר זכוכית, אשר לאחר מכן לזרוח (ירוק). אור ניאון מונחה אז עינו של הצופה (מתואר) או מצלמה CCD. פוטנציאל הממברנה של תאים הדמיה נשלטת זמנית על ידי תיקון, מהדק אותם. גישה זו מאפשרת את המחקר של הקשר בין האותות הנכנסים (מתח קרום) ואת פלט עצבי (exocytosis).

איור 2: תוצאות אופייניות. משמאל: התמונה בשדה בהיר של תא דג זהב בודד דו קוטבית. הימנית העליונה: תמונה TIRF של שלפוחית ​​סינפטית את מסוף האקסון לתא דו קוטבית עמוסה FM 1-43 ® ו צילמו עם 488 ננומטר לייזר (FM צבע). למטה מימין: התמונה של הטרמינל אותו לאחר תיקון תא הדמיה למסוף האקסון עם לייזר 561 ננומטר. סרטים Synaptic מסומנים על ידי הפפטיד RIBEYE מחייב rhodamine מבוססי (Rpep_rhod).

טבלה 1: ריאגנטים ספציפיים ציוד.

טבלה 2: פתרונות פיזיולוגיים השתמשו במחקר זה.

* וצזיום methanesulfonate.
** RIBEYE מחייב פפטיד: rhodamine + EQTVPVDLSVARDR-COOH (MW 1997.75).

היתרונות של מיקרוסקופיה TIRF אובייקטיבית מסוג הן כי 1) הוא מספק חתך אופטית מעולה ידי הגבלת אור עירור לאזור צר בתוך המטוס מוקד של המטרה, ובכך לצמצם out-of-להתמקד אור; 2) מאז אור טיפות אקספוננציאלית עם המרחק תנועה בכיוון אנכי ניתן לנטר כשינוי עוצמת הקרינה, 3) אוסף אור יעיל דרך אובייקטיבית הצמצם גבוה המספרי ^1,5.

החיסרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מוגבלת לאירועים הדמיה קורה בתוך & 100 ננומטר של תא השטח, וזה שווה בערך סעיף Ultrathin במיקרוסקופ אלקטרונים. לכן, להדמיה של אירועים אלה תלויה באופן קריטי על התאים להיות דבק היטב הזכוכית, על נוכחות של סרטים הסינפטי קרוב התיקון של קרום דבק זכוכית ועל טעינת מוצלח של שלפוחית. פרוטוקול שלנו מאפשר טעינה של 1-2% בלבד מכלל של שלפוחית ​​בתוך הטרמינל תא דו קוטבית הסינפטי ^2,6. עם זאת אמר, ברור כי יש אירועים הרבה יותר מתרחש על פני התא מאלו שאנו מסוגלים התמונה.