The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.16.108.167, User IP: 50.16.108.167, User IP Hex: 839937191
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (28), e1305, doi:10.3791/1305 (2009).
الجزء 1 : تشريح القطبين وعزل الخلايا
الجزء 2 : القطبين تحميل الخلية وتغسل
ويتم تصوير أفضل TIRF حويصلات متشابك خارج باستخدام مجهر TIRFM الهدف من نوع مع الهدف NA عالية جدا وكاميرا حساسة. لتجاربنا ، نختار لاستخدام 1.65 NA الهدف (آبو X100 O الموارد البشرية ، NA 1.65 ، أوليمبوس ، واليابان) مع EMCCD (تتالي 512B العلمية روبر ، توكسون ، من الألف إلى الياء). استخدام عالية جدا NA الهدف يتطلب استخدام الزجاج عالية coverslips الانكسار والسوائل الغمر (دى يود الميثان مع الكبريت). تحت ظروفنا ، يقتصر ضوء الإثارة إلى حقل تدهور بشكل كبير ، مع طول ثابت من ما يقرب من 50 نانومتر.
الجزء 3 : تصحيح لقط والتصوير TIRFM
الشكل 1 : الإعداد التجريبية. وتركز الليزر 488 نانومتر (الأزرق) على هامش البؤري الخلفي للموضوعية وتعاني الانعكاس الداخلي الكامل ، عندما يصل إلى واجهة الزجاج المائي المتوسط. الحقل الكهرومغناطيسي التي تم إنشاؤها بواسطة الشعاع المنعكس يثير fluorophore تحميلها في الحويصلات متشابك الأقرب إلى بوتام من الغرفة الزجاجية ، والتي يتألق ثم (الخضراء). ويسترشد ثم ضوء الفلورسنت لعين المراقب (صور) أو كاميرا CCD. يتم التحكم إمكانات غشاء الخلايا المصورة في نفس الوقت عن طريق التصحيح ، تحامل عليها. هذا النهج يتيح للدراسة العلاقة بين الإشارات الواردة (الجهد الغشاء) والإخراج العصبية (إيماس).
الشكل 2 : نتائج نموذجي. اليسار : صورة مشرقة ميدان خلية معزولة ذهبية القطبين. اليمنى : صورة TIRF من الحويصلات متشابك في محور عصبي بين القطبين محطة الخلية محملة FM 1-43 ® والمصورة مع ليزر 488 نانومتر (FM صبغة). أسفل اليمين : صورة للمحطة نفسها بعد خلية التصحيح والتصوير المعبر محوار مع الليزر 561 نانومتر. وصفت شرائط متشابك من الببتيد RIBEYE ملزم رودامين المستندة (Rpep_rhod).
الجدول رقم 1 : الكواشف والمعدات الخاصة.
اسم | نوع | الصانع | فهرس | تعليق |
| -- | الجدول الهواء | شركة نيوبورت | -- | -- |
| IX70 | مجهر مقلوب | اوليمبوس | -- | مجهزة مصباح التنغستن لحقل مشرق وفتح الميناء الوحشي للTIRF |
| TH4 - 100 | مصباح مصدر الطاقة | اوليمبوس | -- | -- |
| FF498_581 - Di01 | تصفية مزدوج اللون | Semrock | -- | -- |
| NF01 - 405_488_568 | تصفية الانبعاثات | Semrock | -- | -- |
| آبو X100 O HR | هدف | اوليمبوس | -- | NA 1.65 |
| RG630 | أحمر تصفية الزجاج | شوت | -- | -- |
| -- | 488 نانومتر ليزر | متماسك | -- | استخدام القوة في الدنيا |
| -- | مصراع | Uniblitz | -- | -- |
| VMM - D1 | مصراع سائق | Uniblitz | -- | -- |
| -- | 561 نانومتر ليزر | ميليس Griot | -- | -- |
| -- | مصراع | Uniblitz | -- | -- |
| VMM - D3 | مصراع سائق | Uniblitz | -- | -- |
| ضغط التروية كيت | Superfusion النظام | أتمتة العلمية | 09-04 | -- |
| نضح القلم | Superfusion النظام | أتمتة العلمية | -- | -- |
| Valvelink 8 | Superfusion نظام تحكم | أتمتة العلمية | -- | -- |
| تتالي 512B | EM كاميرا CCD | روبر العلمية | -- | -- |
| Metamorph 7.1 | برامج التصوير | الأجهزة الجزيئية | -- | -- |
| EPC - 9 | التصحيح المشبك مكبر للصوت | HEKA الكترونيك | -- | -- |
| نبض | برمجيات مكبر للصوت | HEKA الكترونيك | -- | -- |
| MP - 285 | Micromanipulator | سوتر الصك | -- | -- |
| -- | القطب هولدر | HEKA الكترونيك | -- | مقابل 1.5 مم OD الزجاج ، 2 وحدة |
| كويك سن الفيل ® TW150 - 3 | شعرية زجاج البورسليكات | WPI | -- | دون خيوط |
| B150 - 86-10 | شعرية زجاج البورسليكات | سوتر الصك | -- | مع خيوط |
| P - 97 | Microelectrode بولير | سوتر الصك | -- | خيوط مجهزة 3x3 مربع وغرفة البيئية |
| -- | مضخة ضغط الهواء فراغ | توماس العلمية | 7893B05 | يخلق فراغا لإزالة السوائل من الغرفة والضغط الزائد عن ماصات |
| R2008a ماتلاب | تحليل البرمجيات | MathWorks | -- | -- |
| 353001 | 35 ملم صحون بلاستيكية الثقافة | صقر | -- | -- |
| -- | ارتفاع مؤشر الإنكسار للزجاج | PlanOptik | -- | معامل الانكسار 488 نانومتر = 1.78 |
| سلسلة M | ارتفاع مؤشر الإنكسار السائل | Cargille مختبرات | -- | معامل الانكسار = 1.78 |
| Sylgard 184 | السيليكون إلاستومر كيت | داو كورننغ | -- | -- |
| الجلوتاثيون | ثلاثي الببتيد | EMD كيماويات | radica مجانال زبال | |
| هيالورونيداز | انزيم | سيغما | H6254 | النوع الخامس |
| L - السيستين | حمض أميني | Fluka | 30090 | ينشط غراء |
| غراء | انزيم | Fluka | 76220 | من البابايا Carica |
| Trolox ® | ذوبان فيتامين (ه) | سيغما | 56510 | زبال الحرة الراديكالية |
| ADVASEP - 7 | المسلفنة B - Cyclodextrin المشتقة | سيغما | A3723 | يقلل FM 1-43 ® الخلفية مضان |
| FM 1-43 ® | صبغ فلوري | Invitrogen | T35356 | "التعبئة الخاصة" |
| زجة الشمع | ماصة عامل طلاء | مؤسسة كير | -- | انخفاض السعة ماصة |
الجدول 2 : حلول فسيولوجية المستخدمة في هذه الدراسة.
مادة | انخفاض كا 2 + رينغر | السيطرة رينغر | ارتفاع K + رينغر | حلول داخلية |
| كلوريد الصوديوم | 120 ملم | 120 ملم | 97.5 ملي | -- |
| بوكل | 2.5 ملم | 2.5 ملم | 25 ملم | -- |
| MgCl 2 | 1 ملم | 1 ملم | 1 ملم | 4 ملم |
| CaCl 2 | 0.5 ملم | 2.5 ملم | 2.5 ملم | -- |
| HEPES | 10 ملي | 10 ملي | 10 ملي | 10 ملي |
| EGTA | 0.75 ملي | -- | -- | 0.5 ملم |
| جلوكوز | 10 ملي | 10 ملي | -- | -- |
| الجلوتاثيون | 2 ملم | 2 ملم | -- | 1 ملم |
| CH 3 منظمات المجتمع المدني 3 S * | -- | -- | -- | 100 ملي |
| TEACl | -- | -- | -- | 10 ملي |
| ATP - MG | -- | -- | -- | 10 ملي |
| GTP لى | -- | -- | -- | 1 ملم |
| Rpep - rhod ** | -- | -- | -- | 5 ملم |
| حجم | 200 مل | 100 مل | 5 ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
* methanesulfonate السيزيوم.
** RIBEYE ملزم الببتيد : رودامين + EQTVPVDLSVARDR - COOH (1997،75 ميجاوات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
مزايا المجهري TIRF الهدف من النوع هي أن 1) أنه يوفر sectioning البصرية ممتازة من خلال تقييد ضوء الإثارة إلى منطقة ضيقة داخل الطائرة البؤرية لهذا الهدف ، وبالتالي تقليل الخروج من تركيز الضوء ؛ 2) منذ قطرات الضوء بشكل كبير ، مع المسافة يمكن رصد حركة في اتجاه عمودي على أنه تغيير في كثافة مضان ، 3) جمع ضوء كفاءة من خلال الفتحة العددية الهدف 1،5 عالية.
العيب الرئيسي من هذه التقنية هو أن تقتصر على الأحداث التصوير يحدث داخل نانومتر و 100 من سطح الخلية ، وهو ما يعادل تقريبا إلى قسم سامسونج في المجهر الإلكترون. ولذلك ، تصور هذه الأحداث تعتمد بشكل حاسم على الخلايا التي انضمت بحزم على الزجاج ، على وجود أشرطة متشابك على مقربة من رقعة من الغشاء انضمت إلى الزجاج وعلى حويصلات التحميل بنجاح. بروتوكول يتيح لنا تحميل فقط 1-2 ٪ من إجمالي عدد حويصلات داخل الخلية محطة متشابك 2،6 القطبين. مع أن قال ، فمن الواضح أن هناك المزيد من الأحداث الكثير مما يجري على سطح الخلية من تلك التي نحن قادرون على الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY 14990.
