유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

1 부 : CBB의 얼룩 솔루션의 준비

1. CBB의 60-80 MG는 G - 250은 2-4시간에 대한 감동으로 bidistilled 물 1리터에 녹아 있습니다. 마지막으로, 집중 HCL 3 ML은 다른 분간 교반과 함께 진한 파란색 솔루션에 추가하고 나중에 사용하기 위해 어둠에 저장됩니다. 이 솔루션은 그 얼룩의 효율성을 잃지 않고 몇 개월까지 주 동안 최대 저장할 수 있습니다.
2. 집중 HCL은 퓸 후드에서 사용하는 일반적인 치료 깨물어으로 취급해야합니다. 최종 솔루션은 산도 약 2 있으므로 장갑을 사용해야하고 피부와의 접촉을 피해야한다에있을 것입니다.

2 부 : SDS - PAGE

1. 단백질 시료의 적절한 aliquots는 1X 로딩 버퍼의 최종 농도 버퍼를 읽어와 혼합됩니다. 우리는 125mM Tris/H3PO4 (25 ° C에서 산도 7.5), 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 4% SDS, 200mM DTT, 0.02 % bromophenol 파란색과 50 %의 글리세롤과 2X 로딩 버퍼를 사용합니다. SDS - PAGE 다른 로딩 버퍼 잘으로 사용할 수 있습니다.
2. 단백질 샘플이 로딩되기 전에 약 5 분 가열합니다. 한편, 겔 전기 영동 챔버는 실행을위한 준비가되어 있습니다. 우리는 XCell SureLock에 © 비스 - 트리스 젤 (Invitrogen) ® MES - 버퍼와 미니 셀 (Invitrogen)가 실행 버퍼지만 다른 겔 및 전기 시스템뿐만 아니라 사용할 수있는 프리 캐스트 4-12%의 NuPAGE를 사용합니다.
3. 단백질 샘플은 220V 50 분 실행 젤과 전기 영동에로드됩니다.

파트 3 : 젤의 스테 이닝

1. 겔 카세트가 해체되고 젤은 이후 세정 단계를 상자에 배치됩니다.
2. bidistilled 물을 약 100 ML은 겔에 추가하고 30 초 동안 전자 레인지에 가열합니다. 비등가 발생하기 전에 난방을 중단해야합니다. 젤있는 상자는 다음 3-5 분 쉐이크에 위치합니다. 이 세척 단계는 신선한 물로 두 번 반복됩니다.
3. 충분 CBB의 얼룩 솔루션은 상자에 겔 10 초위한 전자 레인지에 가열 상자를 커버에 추가됩니다. 끓는없이. 젤있는 상자 후 얼룩을 마무리를위한 쉐이크에 위치합니다. 이미 일분 후, 단백질 밴드는 15-30 분 후 볼 수 있습니다. 얼룩은 대부분의 경우 충분히 강하.
4. 얼룩 솔루션은 해제 붓고되고 50-100 ML bidistilled 물을 더 쉐이크에서 젤의 하늘색 배경을 destain하기 위해 추가됩니다. 물이 필요한 경우 추가 destaining 신선한 물로 교체하실 수 있습니다.
5. 젤은 스캔한 사진이나 장기 보관을위한 건조 수 있습니다

4 부 : 대표 결과 :

그림을 참조하십시오. 설명 절차에 따라 제대로 스테인드 젤 1.

그림을 참조하십시오. 얼룩 및 잔류 SDS하기 전에 충분히 세탁되지 않은 젤에 대한 2 효율적으로 얼룩을 억제. 마커 차선은 (*) 마커 단백질 같은 금액을 포함합니다.

그림. 1 : 단백질 정제의 샘플 (분자량 마커 *)를 로딩 후 대표 겔 얼룩.

그림. 2 : CBB의 얼룩하기 전에 충분히 세탁되지 않은 CBB 스테인드 젤. 단백질 밴드가 (마커 레인 *이 그림에서와 같이 단백질의 같은 양의 1. 포함되어 있습니다) 약한 나타납니다.

• 세척 단계는 단백질의 효율적인 얼룩을 위해 중요하다. 2 분 또는 물 (<50ml)의 감소 볼륨 아래의 감소 세척 시간은 겔에 잔류 SDS 높은 금액으로 인한 가능성이 가장 높은 하늘색 단백질 밴드에 발생할 수 있습니다.
• 단백질은 질량 분광법으로 분석 될 경우, 전자 레인지에서 가열 단계는 생략한다, 10의 각 단계에서 분 및 밴드 강도까지 연장 얼룩 시간까지 확장 젤의 세탁 시간은 충분히 강하 . 질량 분석법에 의한 겔 매트릭스하기 때문에 단백질의 검출에 단백질의 crosslinking에서 젤 결과를 가열하는 것은 방해 수 있습니다.
• 대신 CBB G - 250, 한 Wondrak에서 원래 프로토콜에 따라 CBB R - 250을 사용할 수 있습니다. 우리 연구실에 CBB G - 250의 재고를했고이 염료와 함께 좋은 결과를 것처럼 우리는 옆에 두 염료 측면을 비교하지 않았습니다.
• 프로 시저의 속도와 세정 얼룩 단계에서 독성 또는 유해 용제의 누락이 프로토콜을 사용하기위한 가장 중요하고 설득력 요소입니다. 감도는 고전적인 CBB의 얼룩 프로토콜과 상업 CBB의 얼룩 솔루션의 동일한 범위에 표현 및 재조합 단백질의 정화 분야에서 우리의 SDS - PAGE 분석을위한 제한 요인되지 않았습니다.