无有机溶剂和醋酸，蛋白质与考马斯亮蓝G - 250凝胶染色

第1部分：CBB染色溶液的制备

1. 60-80毫克CBB G - 250是在1升bidistilled水溶解，搅拌2-4小时。最后，3毫升浓盐酸加入搅拌一分钟，以深蓝色的解决方案，并存储在黑暗供日后使用。该解决方案可存储几个星期到几个月的时间，而不会失去其染色效率。
2. 浓盐酸应处理与常规护理UND通风​​柜下使用。最终的解决方案将在pH为2左右，所以手套，应使用和任何应避免与皮肤接触。

第2部分：SDS - PAGE电泳

1. 蛋白质样品的适当等份混合装载到终浓度为1X样缓冲液的缓冲。我们用125MM Tris/H3PO4（25 ° C时的pH值7.5），EDTA的2MM，4％SDS，200mm的数码地面电视，0.02％溴酚蓝和50％的甘油2X样缓冲液。以及可用于其他装载缓冲区进行SDS - PAGE。
2. 蛋白质样品被加热约5分钟装货前。与此同时，凝胶电泳室的运行准备。我们使用预制4-12％NuPAGE ©双三凝胶（Invitrogen公司）在XCell SureLock ®迷你细胞与MES缓冲（Invitrogen公司）作为运行缓冲液，但任何其他的凝胶电泳系统也可作为使用。
3. 蛋白质样品装入凝胶电泳在220V和50分钟的运行。

第3部分：凝胶染色

1. 凝胶盒拆卸和凝胶放置在一个盒子里，为随后的清洗步骤。
2. bidistilled水约100毫升，加入凝胶，在微波炉加热30秒。沸腾发生之前，应停止暖气。与凝胶的方块，然后放置在一个振动筛为3-5分钟。重复此清洗步骤是用新鲜水的两倍。
3. 补充足够的CBB染色的解决方案是覆盖胶框和框在微波炉中加热10秒。未经煮沸。完成染色，凝胶的方块，然后放置在一个摇床。早1分钟后，蛋白条带，可以观察到，经过15-30分钟。染色是在大多数情况下足够强。
4. 染色溶液浇灭了50-100毫升bidistilled水，以补充，以进一步destain在摇床凝胶的蓝色背景光。进一步脱色如果需要的水可以取代淡水。
5. 凝胶可以被扫描，拍照或长期贮存干燥

第4部分：代表性的成果：

见图。 1所描述的过程，一个正确的染色凝胶。

见图。一个尚未足够长的时间染色前和残留的SDS洗凝胶2，抑制高效率的染色。请注意标记的车道（*）包含相同数量的标志蛋白。

图1：代表加载后的一种蛋白质纯化的样品（分子量标记*）的凝胶染色。

图2：CBB染色凝胶尚未洗净CBB染色前足够长的时间。蛋白条带出现较弱的（请注意，标记巷*包含在图1的蛋白质相同金额）。

• 洗涤步骤是为高效的蛋白质染色是至关重要的。 2分以下或水（<50毫升）的体积缩小减少洗涤时间，可以在淡蓝色的蛋白条带，最有可能由于凝胶中残留的SDS的结果。
• 如果蛋白质质谱分析，在微波炉中加热的步骤应跳过，扩展到约10分钟，每一步和染色时间延长，直到带的强度凝胶洗涤时间足够强大。加热质谱的蛋白质的交联凝胶的凝胶基质，从而检测的蛋白质可能会受到阻碍。
• 相反的CBB G - 250，可以使用CBB R - 250根据原协议由Wondrak。我们有没有比较两种染料方方，在我们的实验室，因为我们有CBB G - 250的股票，这种染料有良好的结果。
• 该过程的速度和遗漏的有毒或有害溶剂，在洗涤和染色步骤是使用此协议的最重要和最有说服力的因素。灵敏度是在同一范围内的古典CBB染色协议和商业CBB染色解决方案，一直没有为我们的SDS - PAGE分析重组蛋白表达和纯化领域中的限制因素。