The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Institut für Biologie - Neurobiologie, Freie Universität Berlin, 2Institut für Biologie - Neurobiologie, Free University Berlin - Freie Universitaet Berlin
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Haehnel, M., Froese, A., Menzel, R. In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee. J. Vis. Exp. (30), e1353, doi:10.3791/1353 (2009).
vivo और सेमीफाइनल में कैल्शियम इमेजिंग के लिए vivo तैयारी Joerges Küttner, और Galizia द्वारा हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया है पर दस साल पहले, antennal 1 पालि में गंध पैदा गतिविधि को मापने के लिए. तब से यह लगातार परिष्कृत किया गया है और मधुमक्खी मस्तिष्क में अलग neuropiles के लिए लागू है. यहाँ, हम वर्तमान में प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता मशरूम शरीर dextran कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई युग्मित (Fura-2) का उपयोग न्यूरॉन्स में गतिविधि को मापने की तैयारी का वर्णन. हम retrogradely उनके axons या सोम क्षेत्र में डाई के इंजेक्शन लगाने के द्वारा मशरूम शरीर न्यूरॉन्स दाग. हम invasiveness कम करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक तैयारी है जिसमें यह अभी भी संभव कंडीशनिंग प्रतिशत का उपयोग मधुमक्खी ट्रेन हासिल. हम निगरानी और मांसपेशियों जो प्रतिशत दो (M17) नियंत्रण से विद्युत myograms रिकॉर्डिंग से व्यवहार प्रतिक्रिया यों कर रहे हैं .
शारीरिक प्रयोग imaged संरचनाओं के बाद अधिक से अधिक confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए न्यूरॉन्स की पहचान का पता के विस्तार में जांच कर रहे हैं.
बी तैयारी और वापस भरें
Vivo इमेजिंग में
गंध और संकेत की उत्तेजना रिकॉर्डिंग
Olfactometer: हम एक कंप्यूटर नियंत्रित, कस्टम बनाया उत्तेजना डिवाइस या "olfactometer" Galizia और 3 वेई्रर द्वारा पहले वर्णित का उपयोग करें. Odors एक निरंतर हवा एंटीना की ओर निर्देशित धारा में पतला कर रहे हैं. कोई उत्तेजना 0.2ml गंध संतृप्त हवा के 3s गंध नाड़ी के होते हैं. उत्तेजना प्रोटोकॉल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर TILLVision में सेट किया जा सकता है.
माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सेट अप: हम एक Zeiss प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें. छवियाँ 25 ° सी के साथ 5 हर्ट्ज के नमूने दर तक - फोटोनिक्स इमेजिंग खुर्दबीन पर घुड़सवार डिवाइस का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं. कैल्शियम संकेतों एक X60, 0.9 डब्ल्यू एक ईमागौ सीसीडी कैमरा (640x480 पिक्सेल, 160x120 पिक्सेल के लिए चिप पर binned 4X) के साथ डुबकी उद्देश्य ओलिंप के माध्यम से दर्ज कर रहे हैं. Fura 2 340 के रंग का प्रकाश और ratiometric मापन के लिए 380nm तरंगदैर्ध्य के साथ उत्साहित है. प्रतिदीप्ति एक 410nm dichroic दर्पण और एक 440nm लंबे समय से गुजारें फिल्टर के माध्यम से पता चला है. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में रिकॉर्डिंग के लिए पैरामीटर सेट कर रहे हैं. प्रत्येक माप रहता है 10s और दो तरंग दैर्ध्य के लिए जोखिम समय प्रत्येक तैयारी में धुंधला तीव्रता को समायोजित किया जा सकता है.
रिकॉर्डिंग M17: labium (M17) के चांदा मांसपेशियों extracellularly दर्ज की गई है व्यवहार सीखने के लिए संबंधित प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने, प्रतिशत 5, 6 अर्थात्. मुँह भागों में करीब मांसपेशी में एक तांबे के तार सुई. आंख में जमीन इलेक्ट्रोड इंजेक्षन. मांसपेशियों की क्षमता एक कस्टम निर्माण पूर्व - प्रवर्धक के साथ परिलक्षित कर रहे हैं, digitalized और एक कंप्यूटर पर संग्रहीत. प्रोत्साहन शुरुआत olfactometer द्वारा ट्रिगर है.
डेटा विश्लेषण
एक साथ dextran Fura-2 के साथ हम fixable डाई rhodamine dextran ("मिनी माणिक") के साथ न्यूरॉन्स को भरने. दोनों रंजक एक ही आणविक भार है, वे किया जाना चाहिए सह न्यूरॉन्स में स्थित है. वाइड क्षेत्र इमेजिंग केवल बहुत सीमित स्थानिक संकल्प की अनुमति देता है, इसलिए यह confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रयोग के बाद दाग संरचनाओं की जांच की सिफारिश की है.
प्रतिनिधि परिणाम:
यदि धुंधला हो जाना और तैयारी सफल रहा था, झूठी रंग के पैमाने में संकेत, मशरूम शरीर अल्फा पालि बाह्य न्यूरॉन्स में उदाहरण के लिए, संख्या 1 में तरह लग सकता है.
व्यवहार प्रतिक्रिया (प्रतिशत) उत्तेजना ऋण उत्तेजना (figure2) से पहले स्पाइक आवृत्ति के दौरान कील आवृत्ति के रूप में गणना की जा सकती है.
दाग संरचनाओं अधिक से अधिक एक confocal खुर्दबीन (figure3) का उपयोग कर विस्तार में जांच की जा सकती है.
चित्रा 1: प्रतिनिधि कैल्शियम इमेजिंग संकेतों (heptanal साथ उत्तेजना). एक: मधुमक्खी मस्तिष्क के imaged क्षेत्र. बी: कच्चा फ्लोरोसेंट छवि 380nm उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर एक डुबकी उद्देश्य X20 के माध्यम से देखा के रूप में, मशरूम शरीर के अल्फा - पालि बैंगनी में उल्लिखित है. डाई-अल्फा lobes के रिम ventro पार्श्व में इंजेक्ट किया गया था करने के लिए बाह्य न्यूरॉन्स दाग. सी: झूठी रंग छवि तीन दूसरा प्रोत्साहन के दौरान औसत संकेत, deltaF (340/380), से व्युत्पन्न, बैंगनी में उल्लिखित अल्फा - पालि, चयनित आरओआई काले में उल्लिखित है. डी: गंध उत्तेजना, ब्याज के क्षेत्र से औसत के संकेत के रूप में सी ई में संकेत के जवाब में कैल्शियम संकेत के टेम्पोरल गतिशीलता: sucrose उत्तेजना ipsi और विपरीत पार्श्व एंटीना के जवाब में कैल्शियम संकेत के टेम्पोरल गतिशीलता रॉय क्रमशः संकेत सी. में
चित्रा 2: प्रतिनिधि M17 प्रतिक्रिया. घ्राण कंडीशनिंग के बाद मधुमक्खी है जब गंध इनाम के बिना प्रस्तुत किया है सूंड फैली हुई है. लाल रेखा गंध उत्तेजना इंगित करता है. इनसेट: मधुप के प्रतिशत.
चित्रा 3: प्रतिनिधि छवि ढेर. इमेजिंग प्रयोग के बाद मस्तिष्क dissected था. संख्या 1 से न्यूरॉन एक X20 तेल विसर्जन उद्देश्य, बैंगनी में उल्लिखित अल्फा पालि के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए स्कैन है.
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इस प्रस्तुति में हम सभी चरणों के माध्यम से चले गए मधुप में vivo कैल्शियम संकेतों में जांच करने के लिए. हम मशरूम शरीर के न्यूरॉन्स के लिए इस तकनीक लागू है, लेकिन इमेजिंग सभी न्यूरॉन्स, जो के लिए एक धुंधला तकनीक स्थापित किया जा सकता है पर किया जा सकता है. हम मधु मक्खी की घ्राण मार्ग में न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया है. प्रयोगों सब एक darkroom में प्रदर्शन कर रहे हैं. सेट अप एक लंबे लहर प्रकाश जो मधुमक्खी के ऑप्टिकल धारणा रेंज के बाहर झूठ और रंजक उत्तेजित नहीं के साथ प्रकाशित किया है. यह महत्वपूर्ण है किसी भी फ्लोरोसेंट कलाकृतियों उदाहरण के सिलिकॉन में हवाई बुलबुले के लिए, से बचने के.
इस प्रणाली का प्रमुख लाभ की संभावना के लिए स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ न्यूरॉन्स में गतिविधि के बारे में जानकारी नमूना है. उसी समय, हम मधुमक्खी में प्रासंगिक व्यवहार का निरीक्षण जब जैसे सीखने न्यूरॉन्स में संबंधित plasticity जांच की जानी है. हालांकि, स्थानिक और लौकिक संकल्प सीमित है. Vivo कैल्शियम इमेजिंग में का प्रयोग, प्रयोगात्मक समय सीमित है . कोशिकी electrophysiological तरीकों के साथ, जबकि रिकॉर्डिंग कई घंटे या दिन के लिए पिछले कर सकते हैं, हमारे प्रयोगों के बारे में 90 मिनट के लिए सीमित कर रहे हैं. सिग्नल अभी भी काफी अच्छा कर रहे हैं जब हम एक 5Hz नमूना दर, प्रत्येक माप स्थायी 10 सेकंड, 340nm 20ms और 380nm जोखिम स्थायी 5ms किया जा रहा जोखिम, क्रमशः में दो तरंगदैर्य द्वारा उत्तेजना के साथ 85 माप प्रदर्शन. बाद में एक समस्या बन सकता है विरंजन डाई.
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इस काम DFG के द्वारा वित्त पोषित है.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme & Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
Thanks.
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ReplyPosted by: Page B.December 4, 2009, 3:53 PM