In vivo Ca ^{2 +} - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant l'apprentissage olfactif dans le Honey Bee

Préparation d'abeille et de remblayage

1. Catch abeilles butineuses à la ruche et le froid sur la glace pour l'immobilisation.
2. Mont d'enregistrement en plexiglas chambres ^3. Fixer les yeux et le thorax pour les murs de la chambre d'enregistrement avec de la cire à point de fusion bas dur.
3. Tirez capillaires en verre que couramment utilisées pour l'électrophysiologie et de pause à la pointe pour obtenir un diamètre de l'extrémité de ca. 10 microns. Couvrir la pointe du capillaire avec de la pâte de teinture. Pâte colorante se compose d'un mélange 10:01 de Fura-2 dextrane et lysine fixable tétraméthylrhodamine dextrane.
4. Pour la procédure de coloration immobiliser antennes avec minutie ou n-eicosane. Supprimer un morceau de la cuticule au-dessus du cerveau et des glandes et de la trachée pousser sur le côté pour permettre l'accès au corps des champignons.
5. Injecter capillaires soit dans le soma ou région axonales des neurones du corps de champignons. Cela peut être fait main libre ou en utilisant un manipulateur micro. Puis restaurer morceau cuticule sur la capsule céphalique et desserrer antennes.
6. Nourrir les abeilles avec une solution de saccharose à 30% avant de les stocker dans une affaire humidifié pendant au moins quatre heures ou une nuit à 20 ° C.

L'imagerie in vivo

1. Empêcher les mouvements de l'ex abeille avec un petit morceau d'éponge qui est pressée contre le ventre et fixe avec un clip ou une bande à la chambre d'enregistrement.
2. Pour empêcher le mouvement du cerveau résultant du pompage de l'œsophage, couper une petite incision dans la cuticule au-dessus du labrum et tirez soigneusement l'œsophage et de ses environs des structures solides pour le mettre sous tension, sans endommager l'œsophage ^4. Couvrir avec deux de silicone composant.
3. Faire des trous avec une aiguille et insérez électrodes en fil pour l'enregistrement de M17.
4. Retirer morceau cuticule, la trachée et des glandes au-dessus du cerveau. Suce heamolymph intérieur de la capsule tête avec un morceau de papier.
5. Remplissez la capsule céphalique avec deux de silicone composant. Il est important que le cerveau est complètement couvert.
6. Abeilles lieu sur scène microscope et placer une goutte d'eau sur la surface de la silicone, de plonger l'objectif du microscope trempette dans la gouttelette. Focus sur les neurones colorés.

Odeur et la stimulation d'enregistrement des signaux

Olfactomètre: Nous utilisons un ordinateur contrôlé, la stimulation périphérique personnalisé construit ou «olfactomètre» comme décrit précédemment par Galizia et Vetter ^3. Les odeurs sont diluées dans un flux d'air constant orienté vers les antennes. Toute relance se compose d'une impulsion de l'odeur de l'air l'odeur 3s 0.2ml saturé. Le protocole de stimulation peut être réglé dans le TILLVision logiciel d'enregistrement.
Microscope et imagerie mis en place: Nous utilisons un microscope à fluorescence Zeiss. Les images sont enregistrées à 25 ° C avec un taux d'échantillonnage de 5 Hz en utilisant un dispositif d'imagerie photonique TILL-monté sur le microscope. Signaux calciques sont enregistrées grâce à un X60, Olympus 0,9 W DIP objectif avec une caméra CCD Imago (640x480 pixels, 4X binned sur puce à 160x120 pixels). Fura-2 est excité par une lumière monochromatique de longueur d'onde 340 et 380nm pour les mesures ratiométrique. La fluorescence est détectée à travers un miroir dichroïque 410 nm et un filtre passe 440 nm de long. Les paramètres pour l'enregistrement sont définis dans le logiciel d'enregistrement. Chaque mesure dure 10s et le temps d'exposition pour les deux longueurs d'onde peut être ajustée à l'intensité de coloration dans chaque préparation.
M17 enregistrement: Le muscle rapporteur du labium (M17) est enregistrée de façon extracellulaire de surveiller les réponses comportementales liées à l'apprentissage, c'est à dire le ^{5 p., 6.} Injecter un fil de cuivre dans le muscle près de la bouche de pièces. Injecter électrode de masse dans l'œil. Les potentiels musculaires sont amplifiés avec une version personnalisée de pré-amplificateur, numérisés et stockés sur un ordinateur. Le début du stimulus est déclenchée par l'olfactomètre.

Analyse des données

1. Pendant l'expérience: Les enregistrements du signal de calcium sont introduits dans un ordinateur et stockées. Le logiciel d'enregistrement TILLVision permet une inspection initiale des signaux, comme le calcul du rapport entre les longueurs d'onde (340nm/380nm) et le calcul des deltaF (soustraction de base).
2. Traitement de l'image est réalisée avec la coutume des programmes écrits en langage IDL. Calculer le ratio de Ca ^{2 +} signaux de 340nm et 380nm mesures pour chaque pixel. Déterminer fond de fluorescence (F) en moyenne plus de cadres avant le stimulus et soustraire au signal ratiométrique (deltaF).
3. Pour définir la région d'intérêt (ROI): Calculer moyenne des cadres lors de la relance et appliquer un filtre passe-bas (3X3px). Convertir une échelle de gris à l'échelle de couleurs fausses. Déterminer l'activité dans les structures neuronales comme des taches d'activité dans les images en fausses couleurs et de définir comme un retour sur investissement.
4. Calculer la dynamique temporelle des régions actives en faisant la moyenne des pixels dans la ROI sur toutes les trames sans aucun filtrage ou de correction.

En collaboration avec le dextrane Fura-2, nous remplissons les neurones avec le colorant rhodamine fixable dextrane ("mini-ruby"). Les deux colorants ont le même poids moléculaire, ils doivent être co-localisés dans les neurones. Imagerie à grand champ ne permet que la résolution spatiale très limitée, il est donc recommandé d'étudier les structures tachés après l'expérience en utilisant la microscopie confocale à balayage.

1. Après les mesures physiologiques, disséquer les cerveaux et les fixer.
2. Rincer avec du PBS et déshydrater par étapes dans l'éthanol et le salicylate de méthyle dans les claires.
3. Pour la microscopie confocale intégrer cerveau en salicylate de méthyle.
4. Nous utilisons un Leica TCS SP2 microscope. Longueur d'onde d'excitation est 543nm.
5. Nous scannons le cerveau avec un air ou un objectif à immersion et de comparer les structures colorées avec les données d'imagerie.

Les résultats représentatifs:

Si la coloration et la préparation a été réussie, le signal à l'échelle de fausses couleurs, par exemple dans le corps du lobe des champignons neurones alpha extrinsèques, pourrait ressembler à la figure 1.
La réponse comportementale (PER) peut être calculée comme la fréquence pic lors de la relance moins fréquence pic avant le stimulus (figure 2).
Les structures tachés peuvent être étudiés plus en détail à l'aide d'un microscope confocal (figure 3).

Figure 1: Représentant des signaux d'imagerie calcique (stimulation avec heptanal). A: région imagée du cerveau d'abeille. B: Raw image fluorescente comme vu à travers un objectif à immersion X20 longueur d'onde d'excitation 380nm, l'alpha-lobe du corps champignon est décrite en violet. Dye a été injecté dans la jante ventro-latérale des lobes alpha-tacher neurones extrinsèques. C: l'image en fausses couleurs à partir du signal moyenne, deltaF (340/380), lors de la relance trois secondes; alpha du lobe décrites en violet, sélectionnés ROI bordées de noir. D: Dynamique temporelle du signal calcique en réponse à la stimulation d'odeurs, de signal moyen de la région d'intérêt, comme indiqué dans C. E: Dynamique temporelle du signal calcique en réponse à la stimulation de saccharose de l'IPSI et contra-latérale antenne respectivement à la RSI indiquée en C.

Figure 2: Représentant M17 réponse. Après conditionnement olfactif de l'abeille s'étend la trompe lorsque l'odeur est présenté sans récompense. La ligne rouge indique relance odeur. En médaillon: PER de l'abeille.

Figure 3: la pile d'images représentant. Après l'expérience d'imagerie du cerveau a été disséqué. Le neurone de la figure 1 est scanné à l'aide d'un microscope confocal avec un objectif X20 immersion dans l'huile, l'alpha-lobe décrites en violet.

Dans cette présentation, nous avons traversé toutes les mesures nécessaires pour enquêter dans les signaux calciques in vivo chez l'abeille. Nous avons appliqué cette technique à des neurones du corps de champignons, mais l'imagerie peut être effectuée sur tous les neurones pour lesquels une technique de coloration peut être établie. Nous nous sommes concentrés sur les neurones de la voie olfactive de l'abeille. Les expériences sont toutes effectuées dans une chambre noire. La mise en place est illuminée par une lumière à ondes longues qui se trouve hors de portée perception optique de l'abeille et n'excite pas les colorants. Il est important d'éviter toute artefacts fluorescents, des bulles d'air par exemple dans le silicone.

Un des principaux avantages de ce système est la possibilité de goûter à des informations sur l'activité des neurones avec une résolution spatiale et temporelle. Dans le même temps, nous pouvons observer le comportement en question chez l'abeille par exemple, lorsque la plasticité d'apprentissage liées dans les neurones est d'être étudiée. Toutefois, la résolution spatiale et temporelle est limitée. L'utilisation de l'imagerie calcique in vivo, le temps d'expérimentation est limité. Alors, avec extracellulaire méthodes électrophysiologiques, les enregistrements peuvent durer plusieurs heures ou jours, nos expériences sont limitées à environ 90 minutes. Les signaux sont encore raisonnablement bien quand nous effectuons des mesures 85 à excitation par deux longueurs d'onde à une fréquence d'échantillonnage 5Hz, chaque mesure doit durer 10 secondes, l'exposition étant 340nm 20ms et une exposition de 5ms 380nm durable, respectivement. Après teinture blanchiment peut devenir un problème.