Поколение прав CD40 активированных В-клеток

Протокол для поколения человеческие CD40 активированных В-клеток РВМС делится на две части: часть демонстрирует подготовку CD40 лиганд выражения NIH/3T3 клетки, которые будут использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерные клетки. Часть В описывает фактические CD40-B культуры.

А. Подготовка фидерных клеток (tCD40L NIH/3T3)

TCD40L NIH/3T3 является сторонником мышиной линии клеток фибробластов, которые никогда не должны стать полностью вырожденная. Клетки, таким образом, разделил два раза в неделю. Культивирование в течение более 6 недель не рекомендуется.

1. Удалить старые среды от первичной культуры с стерильной пипетки и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте PBS после мытья.
2. Добавить 4 мл трипсина / ЭДТА в 75 см ² колбы в течение 5-10 минут при температуре 37 ° C. Используйте нежное нажмите, чтобы отделить клетки.
3. Добавьте 10 мл дикий тип среды и поворота мягко.
4. Передача клеточной суспензии в 50 мл трубки с стерильной пипетки и спина ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 мин.
5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл дикий тип среды. Граф количества клеток аликвоту суспензии клеток и подготовить три 50 мл трубки с соответствующим количеством клеток:
   1. 1,5 х 10 ⁶ клеток для субкультивирования
   2. 0,2 х 10 ⁶ клеток / лунку для облучения используется для CD40-B культуре клеток
   3. Остальная заморозить (при необходимости).
6. Спиновые ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 мин.
7. Удалить супернатант.
   1. Для субкультивирования: ресуспендирования 1,5 х 10 ^{6 клеток} в 10 мл дикий тип среды в 75 см ² колбы культуры клеток (плотность клеток 1,5 х 10 ⁵ клеток / мл), добавить G-418 [0,7 мг / мл] и инкубировать клеток 37 ° C с 5% CO _2. Сплит клетки два раза в неделю.
   2. Для CD40-B культуре клеток: Вам нужно 1,2 х 10 ^{6 клеток} на один 6-луночный планшет. Ресуспендируют клеток в дикой среде типа с плотностью 0,1 х 10 ^{6 клеток} / мл и облучать их на 78 Гр. Пластина 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать их при температуре 37 ° C с 5% CO _2. Используйте этот подготовленные пластины для В-клеток при стимуляции tCD40L NIH/3T3 клетки приверженцем (по крайней мере 4 часа: проверять соблюдение с микроскопа, не ждать более 24 ч до начала В-клеточной стимуляции). (Продолжить с Б.)

Б. CD, 40-Б культуре клеток

I. Подготовка МНПК для стимуляции CD40 (день 0):

Обратите внимание: перед тем как продолжить констатировать, что фидерных клеток являются приверженцем. Всегда добавляйте свежие решения интерлейкина-4 и циклоспорина в питательную среду непосредственно перед употреблением.

1. Возьмите МНПК, либо свежие или надлежащим образом талой. Ресуспендируют МНПК дважды в 50 мл 1 раз PBS, чтобы вымыть их и со спином вниз впервые на 265 мкг в течение 7 минут, а второй раз при 190 мкг в течение 7 минут, чтобы удалить другие клетки. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 20 мл PBS. Определить номер ячейки в аликвоту клеточной суспензии.
2. Спином вниз необходимое количество клеток в 225 мкг в течение 5 мин. Для 6-луночный планшет 4 х 10 ⁶ клеток / лунку необходимо, таким образом, 24 х 10 ^{6 клеток} на чашку.
3. Удалить супернатант и ресуспендируйте РВМС на 1 х 10 ^{6 клеток} / мл в CD40-B культуральной среде недавно дополнена с 50 ЕД / мл интерлейкина-4 в качестве фактора роста и 0,63 мкг / мл циклоспорин для предотвращения результатом Т-клеток (С учетом концентрации относятся к одной среды культуры мл!).
4. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с tCD40L NIH/3T3 клеток.
5. Вымойте приверженцем tCD40L NIH/3T3 клеток с 2 мл PBS на лунку первом и во втором шаге 2 мл CD40-B средний стирки.
6. Аккуратно добавить 4 мл РВМС подвески (1 х 10 ⁶ клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
7. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO _2.
8. На 7-й день, reculture клеток (Продолжить 3.2.).

II. Рекультивация CD40-лимфоцитов (7-й день, а затем каждые 3-4 дня):

1. Урожай кластеров CD40-лимфоцитов из 6-луночный планшет по ресуспендированием с 10 мл пипетки и бассейном их в 50 мл трубки.
2. Спином вниз на 225 мкг в течение 7 минут и полностью заменяют собой супернатант с CD40-B средний стирки. При подсчете количества ячейки аликвоту, спина ячейки вниз на 225 мкг в течение 5 минут. Ресуспендируют CD40-клеток в CD40-B культуральной среде при концентрации 1 х 10 ^{6 клеток} / мл.
3. Добавить свежие решения интерлейкина-4 в концентрации 50 ЕД / мл и 0,63 мкг / мл циклоспорин в среду.
4. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с tCD40L NIH/3T3 клеток.
5. Вымойте прилипшие клетки с 2 мл PBS на лунку первом и во втором шаге 2 мл CD40-B средний стирки.
6 клеток / мл) CD40-B подвески в каждую лунку 6-луночный планшет.
6. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO ^2.
7. Субкультура клетки снова каждые 3-4 дней, чтобы закончить с высокой чистоты человеческого CD40 активированных В-клеток после общей сложности 14 дней.

C. Устранение неисправностей - Что делать, если CD40-B клетки не растут?

1. Проверяли ли Вы для CD40 лиганд выражение фидерных клеток?
2. Пластинчатых связаны фидерные клетки используются для стимуляции не должны быть старше 24 часа?
3. Является ли загрязнение микоплазмой возможно?
4. Был интерлейкина-4 раствор, используемый для добавки свежей талой и имел соответствующее биологической активности?
5. Был циклоспорина добавили в правильной концентрации?

Рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения фигуры 1.

Рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения на рисунке 2.