Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

, , , ,

Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.224.79.93, User IP: 54.224.79.93, User IP Hex: 920670045

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

Abstract: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) זוהו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור חיסוני סרטן 1-3. לעומת תאים דנדריטים (DCS), APC מאופיין הטובה ביותר, תאים CD40-B יש מספר מאפיינים ביולוגיים טכני מובהק. בדומה DCs, תאים B להראות ביטוי מוגבר של MHC ושיתוף גירוי מולקולות (Fig.1b), מפגינים יכולת הנדידה חזק מצגת להציג ביעילות אנטיגן ותאי T, לאחר גירוי עם ליגנד interleukin-4 ו CD40 (CD40L). עם זאת, בניגוד DCs בוגר או בוגרת, CD40 בתאי B-לבטא את לימפה הצומת השלישיה ביות מלא המורכב CD62L, CCR7/CXCR4, ותפקוד ליקוציט אנטיגן-1 (LFA1, CD11a/CD18), הכרחי ביות הלימפה לאיברים משני (Fig.1a) 3. תאים CD40-B יכול להיווצר ללא קשיים של כמויות קטנות מאוד של דם היקפיים אשר ניתן להרחבה נוספת במבחנה על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים סרטניים (> 10 9 תאים לכל מטופל) מתורמים בריאים, כמו גם חולים (Fig.1c, ד) 1,4.

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו CD40-B תאים PBMC האדם. מולקולות מרכזיות בתרבות התא CD40 ליגנד, interleukin-4 (IL-4) ציקלוספורין A (CSA), אשר מתחדש בכל יום מחזור 3-4 התרבות. לענין מעבדה CD40 גירוי מסופק על ידי תאים NIH/3T3 להביע רקומביננטי אנושי CD40 ליגנד (tCD40L NIH/3T3) 5. כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 האדם על transfectants יש להיבדק באופן קבוע (Fig.2).

לאחר 14 ימים CD40-B בתרביות תאים מורכבים יותר טהור 95% תאים B ו הרחבה של CD40-B תאים מעל 65 ימים ניתן לעתים קרובות ללא כל אובדן של 1 לתפקד, 4. תאים CD40-B ביעילות לקחת, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T 6. הם לא רק naϊve הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון בתאי T 7,8. CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell, הפעלת התמיינות ותפקוד. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור חיסון או טיפול מונע נגד גידולים 9.

Protocol: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים אנושיים B מ PBMC מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד להביע NIH/3T3 תאים, אשר ישמש צלחת הנכנס לתאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל CD40-B.

א הכנת תאים מזין (tCD40L NIH/3T3)

NIH/3T3 tCD40L הוא תא חסיד Murine פיברובלסטים קו, שלא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ.

  1. הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה.
  2. הוסף 4 מ"ל טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס"מ 2 למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים.
  3. הוסף 10 מ"ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות.
  4. מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ"ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5.
  5. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ"ל עם מספר מתאים של תאים:
    1. 1.5 x 10 6 תאים subculturing
    2. 0.2 x 10 6 תאים / היטב הקרנה המשמש תרבות CD40-B לתא
    3. שאר להקפיא (במידת הצורך).
  6. ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5.
  7. הסר את supernatant.
    1. עבור subculturing: resuspend 1.5 x 10 6 תאים 10 מ"ל בינוני בר להקליד 75 ס"מ 2 בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 1.5 x 10 5 תאים / מ"ל), מוסיפים G-418 [0.7 מ"ג / מ"ל] ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2. פיצול התאים פעמיים בשבוע.
    2. במשך תרבות CD40-B התא: אתה צריך 1.2 x 10 6 תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים בינוני סוג בר בצפיפות של 0.1 x 10 6 תאים / מ"ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ"ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tCD40L NIH/3T3 תאים חסיד (לפחות 4 שעות: הדבקות לבדוק עם מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב)

ב 40 CD-B תרבית תאים

I. הכנת PBMCs לגירוי-CD40 (יום 0):

שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טריים של interleukin-4 ו ציקלוספורין למדיום הגידול מיד לפני השימוש.

  1. קח PBMCs, או טרי או מופשר כראוי. Resuspend PBMCs פעמיים 50 מ"ל של 1x PBS לשטוף אותם ספין למטה בפעם הראשונה ב XG 265 דקות 7 ופעם שנייה ב XG 190 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 20 מ"ל של PBS. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא.
  2. ספין למטה הכמות הנדרשת של תאים ב XG 225 דקות 5. עבור צלחת 6-באר 4 x 10 6 תאים / גם יש צורך, ובכך 24 x 10 6 תאים לכל צלחת.
  3. הסר את supernatant ו resuspend PBMC ב 1 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום CD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 50 U / mL של interleukin-4 כגורם צמיחה 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין כדי למנוע תוצאה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ"ל!).
  4. הסר את supernatant מ 6 גם צלחת מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L.
  5. שטפו את חסיד tCD40L NIH/3T3 תאים עם 2 מ"ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ"ל של מדיום CD40 B-הכביסה.
  6. בעדינות להוסיף 4 מ"ל של השעיה PBMC (1 x 10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
  7. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2.
  8. ביום 7, reculture התאים (המשך 3.2.).

השנייה. Recultivation של CD40-B תאים (יום 7 ואז כל 3-4 ימים):

  1. הבציר אשכולות של CD40 בתאי B-6-מהצלחת היטב על ידי resuspending עם פיפטה 10 מ"ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ"ל.
  2. ספין למטה XG 225 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום CD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 225 במשך 5 דקות. Resuspend CD40 בתאי B-בינוני CD40 B-תרבות בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
  3. הוספת פתרונות טריים של interleukin-4 בריכוז של 50 U / mL ו - 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ​​ציקלוספורין למדיום.
  4. הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L.
  5. לשטוף את התאים חסיד עם 2 מ"ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ"ל של מדיום CD40 B-הכביסה.
    6. 6 תאים / מ"ל) של השעיה CD40-B היטב בכל צלחת 6-הבאר.
  6. דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2.
  7. תאים תת שוב כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים אנושיים B לאחר סך של 14 ימים.

ג בעיות הירי - מה אם תאים CD40-B אינם גדלים?

  1. בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין?
  2. צלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי לא צריך להיות מעל גיל 24 שעות?
  3. האם זיהום אפשרי עם mycoplasma?
  4. האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי והיה לו את הפעילות הביולוגית המתאים?
  5. האם ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון?

איור 1
באיור 1. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2
איור 2. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

Materials: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 g/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 g/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 g/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 g/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 g/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 g/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 g/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 g/mL)
rh Transferrin (50 g/mL)
rh Insulin (5 g/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

References: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

  1. Schultze, J.L. et al., CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest 100 (11), 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J.L., Grabbe, S., & von Bergwelt-Baildon, M.S., DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol 25 (12), 659-664 (2004).
  3. von Bergwelt-Baildon, M. et al., CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood 107 (7), 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. et al., Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE 3 (1), e1464 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G.J., & Anderson, K.C., CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood 85 (7), 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., & Hwu, P., CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res 63 (11), 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M.S. et al., Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood 99 (9), 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. et al., CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol 155 (2), 249-256 (2009).
  9. Mason, N.J. et al., RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther 15 (13), 955-965 (2008).

Ask the Author: הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

5 Comments

I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after 24 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

1

Reply

Posted by: AnonymousOctober 21, 2009, 5:48 AM

The 3T3 cells are adherent after 12 to 24h incubation and yes they can be used for co-culture.

1.1

Reply

Posted by: Alexander S.October 21, 2009, 8:49 AM

This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/4402-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

2

Reply

Posted by: AnonymousOctober 21, 2009, 5:40 PM

You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

2.1

Reply

Posted by: Alexander S.October 22, 2009, 10:07 AM

Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

2.1.1

Reply

Posted by: AnonymousNovember 14, 2009, 12:11 PM

where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

3

Reply

Posted by: jleventhalMay 6, 2010, 6:56 PM

Hi,
I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

4

Reply

Posted by: RangApril 4, 2011, 4:56 PM

i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

5

Reply

Posted by: Mustafa A.September 10, 2012, 7:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter