ヒトCD40活性化B細胞の生成 (Translated to Japanese)

Cite this Article: ヒトCD40活性化B細胞の生成

Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

Abstract: ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40活性化B細胞（CD40 - B細胞）癌免疫療法^1-3免疫刺激抗原提示細胞（APC）の代替源として同定されている。樹状細胞（DC）、最も特徴的なAPCに比べて、CD40 - B細胞は、いくつかの異なる生物学的および技術的な性質を持っている。樹状細胞と同様に、B細胞はMHCと共刺激分子（図1b）の発現増加を示す、インターロイキン4およびCD40リガンド（CD40L）による刺激の後、強い遊走能と効率的にT細胞に存在する抗原提示を示す。しかし、未成熟または成熟DCとは対照的に、CD40 - B細胞はCD62L、CCR7/CXCR4から成る完全なリンパ節ホーミングトライアドを表現し、二次リンパ器官へのホーミングに必要な白血球機能抗原-1（LFA1、CD11a/CD18）、（図^1A）3。 CD40 - B細胞は、さらに高純度のCD40 - B健康なドナーからの細胞（患者あたり> 10 ⁹細胞）だけでなく、癌の非常に大量にin vitroで拡張することができる末梢血中の非常に少量から困難なしで生成することができます。患者^{（Fig.1c、D）1,4。}

このプロトコルでは、ヒトPBMCから完全に活性化されたCD40 - B細胞を取得する方法を示します。細胞培養のための重要な分子は、CD40リガンド、インターロイキン-4（IL - 4）とシクロスポリン（CSA）、3〜4日の文化のサイクルで補充されている。です。実験の目的のためにCD40刺激は、組換えヒトCD40リガンドを発現NIH/3T3細胞（tCD40L ^NIH/3T3）5によって提供されます。非トランスフェクト細胞の混入を避けるために、トランスフェクタントでヒトCD40リガンドの発現は、（図2）定期的にチェックする必要があります。

14日後にCD40 - B細胞の培養は、65日間にわたって95％以上の純粋なB細胞とCD40 - B細胞の増殖から構成されて関数^1、4のいずれかを失うことなく頻繁に可能です。 CD40 - B細胞は、効率的に、プロセスを占有し、T細胞に存在する抗原^6。彼らだけでなく、素数ナイーブを行うだけでなく^、7,8メモリーT細胞を展開します。 CD40活性化B細胞はB細胞の活性化、分化と機能を研究するために使用することができます。また、彼らは腫瘍⁹に対する治療または予防接種のための有望なツールを表しています。

Protocol: ヒトCD40活性化B細胞の生成

パートプレート結合フィーダー細胞として使用されるNIH/3T3細胞を発現するCD40リガンドの準備を示しています：PBMCからヒトCD40活性化B細胞を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています。パートBは、実際のCD40 - Bの文化を説明します。

フィーダー細胞のA.準備（tCD40L NIH/3T3）

tCD40L NIH/3T3は完全にコンフルエントになることはありません接着マウス繊維芽細胞株、です。細胞は、そのため1週間に2回分かれています。以上の6週間以上の培養が推奨されていません。

滅菌ピペットを用いて初代培養から古い培地を除去し、1 × PBS 10 mLで細胞を洗浄。洗浄後PBSを吸引除去する。
37℃で5-10分は75 cm ^2のフラスコに4 mLのトリプシン/ EDTAを追加℃に細胞を分離するために穏やかなタッピングを使用してください。
野生型の培地10mLを加え、穏やかに回転さ。
滅菌ピペットで50mLのチューブに細胞懸濁液を移し、5分間、225 × gで細胞をスピンダウン。
上清を除去し、野生型の培地10mLにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液のアリコートの細胞数をカウントし、適切な数の細胞を3つの50 mLの試験管を準備します。
1. 継代のための1.5 × 10 ⁶細胞
2. 0.2 × 10 ⁶細胞/ウェルCD40 - B細胞の培養に用いる照射
3. フリーズして残り（必要に応じて）。
5分で225 × gで細胞をスピンダウン。
上清を取り除く。
1. 継代培養のために：再懸濁し、1.5 × 10 ⁶細胞を75センチメートル²細胞培養フラスコ（細胞密度1.5 × 10 ⁵細胞/ mL）10 mLの野生型媒体において、[0.7 mg / mLの] G - 418を追加し、で細胞をインキュベート37℃、5％CO ₂とC。週2回のセルを分割する。
2. CD40 - B細胞の培養には：1つの6ウェルプレート用1.2 × 10 ⁶細胞を必要とする。 0.1 × 10 ⁶細胞/ mLの密度で野生型の培地で細胞を再懸濁し、78 Gyの時にそれらを照射する。よくそれぞれ、37でそれらをインキュベート° C、5％のCO ₂に細胞懸濁液のプレートを2mL。 tCD40L NIH/3T3細胞が接着のときB細胞の刺激のために、この準備のプレートを使用する（少なくとも4時間：顕微鏡による遵守を確認するには、B細胞の刺激を開始するために24時間以上待機しません）。（bに進みます。）

B. CD 40 - Bの細胞培養

CD40刺激（0日）のための末梢血単核細胞のI.の準備：

ご注意：あなたは、フィーダー細胞が接着していることを確かめる続行する前に。常に使用直前に増殖培地にインターロイキン-4およびシクロスポリンの新鮮なソリューションを追加します。

新鮮あるいは適切に融解したPBMCを、取る。再懸濁し、それらを洗浄し、他の細胞を除去するために7分間で190 × gで7分と二度目の256 × gで初めてスピンダウンするの1X PBS 50mLのに二回末梢血単核細胞。上清を捨て、PBS 20mLに細胞を懸濁します。細胞懸濁液の一定量の細胞数を決定します。
5分で225 xgで細胞の必要量をスピンダウン。 6ウェルプレート4の場合は× 10 ⁶細胞/ウェルので、プレート当たり24 × 10 ⁶細胞、必要とされています。
上清を除去し、新鮮なT -細胞の伸長を防止するための成長因子としてのインターロイキン-4および0.63μg/ mLのシクロスポリンの50 U / mLで補ったCD40 - B培地で1 × 10 ⁶細胞/ mLでPBMCを再懸濁します。（与えられた濃度は1枚のMLの培地を参照してください！）。
6ウェルプレートtCD40L NIH/3T3細胞をプレインキュベートから上清を取り除く。
ウェルあたり最初とCD40 - B洗浄培地2mlで2番目のステップで2mLのPBSで接着tCD40L NIH/3T3細胞を洗浄。
穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにPBMC懸濁液を4mL（1 × 10 ⁶細胞/ mL）を追加します。
37細胞をインキュベート° C、5％のCO _2。
7日目に、細胞を（3.2に進みます。）reculture。

II。 CD40 - B細胞（7日目、その後3〜4日ごと）のRecultivation：

50 mlチューブに10 mLのピペットとプール一緒に再懸濁することにより6 - ウェルプレートからCD40 - B細胞の収穫クラスター。
7分で225 × gでスピンダウンし、完全にCD40 - Bの洗浄媒体を使用して上清を交換してください。アリコートの細胞の量をカウントしながら、5分間、225 xgで細胞をスピンダウン。 1 × 10 ⁶細胞/ mLの濃度でCD40 - B培地で再懸濁し、CD40 - B細胞。
培地に50 U / mLおよび0.63μg/ mLのシクロスポリンの濃度のインターロイキン-4の新鮮なソリューションを追加。
6ウェルプレートtCD40L NIH/3T3細胞をプレインキュベートから上清を取り除く。
よく最初とCD40 - B洗浄培地2mlで2番目のステップのあたり2mLのPBSで付着細胞を洗浄する。

6細胞/ mL）を追加します。

37プレートをインキュベート℃、5％のCO ^2。

継代培養細胞は、再び3〜4日ごとに14日間の合計の後に高純度のヒトCD40活性化B細胞で終わるために。

C.トラブルシューティング - 何かのCD40 - B細胞は増殖しないのですか？

あなたは、フィーダー細胞のCD40リガンド発現について確認しましたか？
プレートに結合刺激のために使用されるフィーダー細胞は、24時間以上経過すべきではない？
マイコプラズマ可能で汚染されていますか？
補充のために使用されるインターロイキン- 4ソリューションは、新鮮に解凍し、適切な生物学的活性を有していた？
シクロスポリン正しい濃度で添加されたのはいつですか？

図1：してくださいこちらをクリックして図1の拡大版のために。

図2：してくださいこちらをクリックして図2の拡大バージョンのために。

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Disclosures: ヒトCD40活性化B細胞の生成

Materials: ヒトCD40活性化B細胞の生成

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 �g/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 �g/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 �g/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 �g/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 �g/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 �g/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 �g/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 �g/mL)
rh Transferrin (50 �g/mL)
rh Insulin (5 �g/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:

DMEM / Ham’s F12	PAA Laboratories	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	Cat No T0665
Insulin human	Sigma-Aldrich	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis AG	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA Laboratories	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA Laboratories	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:

Sterile pipette tips	Sarstedt Ltd
6-well plate	Nalge Nunc international	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Biosciences	Cat No 352070
Tissue culture flask	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002

References: ヒトCD40活性化B細胞の生成

Schultze, J.L. et al., CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest 100 (11), 2757-2765 (1997).
Schultze, J.L., Grabbe, S., & von Bergwelt-Baildon, M.S., DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol 25 (12), 659-664 (2004).
von Bergwelt-Baildon, M. et al., CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood 107 (7), 2786-2789 (2006).
Wiesner, M. et al., Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE 3 (1), e1464 (2008).
Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G.J., & Anderson, K.C., CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood 85 (7), 1903-1912 (1995).
Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., & Hwu, P., CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res 63 (11), 2836-2843 (2003).
von Bergwelt-Baildon, M.S. et al., Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood 99 (9), 3319-3325 (2002).
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5 Comments

I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after 24 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

Posted by: AnonymousOctober 21, 2009, 5:48 AM

The 3T3 cells are adherent after 12 to 24h incubation and yes they can be used for co-culture.

1.1

Posted by: Alexander S.October 21, 2009, 8:49 AM

This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/4402-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

Posted by: AnonymousOctober 21, 2009, 5:40 PM

You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

2.1

Posted by: Alexander S.October 22, 2009, 10:07 AM

Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

2.1.1

Posted by: AnonymousNovember 14, 2009, 12:11 PM

where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

Posted by: jleventhalMay 6, 2010, 6:56 PM

Hi,
I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

Date Published	10/16/2009
JoVE Section	General
JoVE Issue	32
Comments	5 Comments
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DOI	doi:10.3791/1373

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ヒトCD40活性化B細胞の生成

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