Geração de humanos CD40-activated células B

O protocolo para a geração de células CD40-activated B da CMSP é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação de CD40 ligante expressar NIH/3T3 células, que serão usados ​​como células da placa-bound alimentador. Parte B descreve a cultura CD40-B real.

A. Preparação de células alimentadoras (tCD40L NIH/3T3)

O NIH/3T3 tCD40L é uma linha de células aderentes murino de fibroblastos, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.

1. Remova o meio de idade a partir da cultura primária com uma pipeta estéril e lavar as células com 10 mL de PBS 1x. Aspirar o PBS após a lavagem.
2. Adicionar 4 mL Tripsina / EDTA em um frasco de 75 cm ² por 5-10 minutos a 37 ° C. Use tocando suave para retirar as células.
3. Adicionar 10 mL de meio de tipo selvagem e giratória suavemente.
4. Transferir a suspensão de células em um tubo de 50 mL com uma pipeta estéril e girar a células para baixo a 225 xg por 5 min.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de meio de tipo selvagem. Conte o número de células de uma alíquota da suspensão de células e preparar três tubos de 50 mL com o número adequado de células:
   1. 1,5 x 10 ⁶ células para subcultura
   2. 0,2 x 10 ⁶ células / poço de irradiação utilizadas para a cultura de células CD40-B
   3. restante para congelar (se necessário).
6. Spin the células para baixo de 225 xg por 5 min.
7. Remover o sobrenadante.
   1. Para subcultura: ressuspender 1,5 x 10 ⁶ células em 10 mL de médio tipo selvagem em um frasco de 75 centímetros de cultura de células ² (densidade celular de 1,5 x 10 ⁵ células / mL), adicione G-418 [0,7 mg / mL] e incubar as células em 37 ° C com 5% de CO _2. Dividir as células duas vezes por semana.
   2. Para a cultura de células CD40-B: Você precisa de 1,2 x 10 ⁶ células para uma placa de 6 poços. Ressuspender as células em meio de tipo selvagem com uma densidade de 0,1 x 10 ⁶ células / mL e irradiar-los em 78 Gy. Placa de 2 mL da suspensão de células em cada poço e incube-os a 37 ° C com 5% de CO _2. Utilize este placas preparado para a estimulação de células B, quando tCD40L NIH/3T3 células são aderente (pelo menos 4 horas: verificar a aderência com o microscópio, não espere mais de 24 h para iniciar a estimulação de células B). (Continue com B.)

B. CD 40-B de cultura de células

I. Elaboração de PBMCs para CD40-estimulação (dia 0):

Por favor note: antes de continuar determinar que as células de alimentação são aderentes. Sempre adicionar novas soluções de interleucina-4 e ciclosporina A para o meio de crescimento imediatamente antes da utilização.

1. Tome PBMCs, fresco ou descongelado adequadamente. Ressuspender PBMCs duas vezes em 50mL de PBS 1x para lavá-los e spin down primeira vez em 265 xg por 7 min e uma segunda vez em xg 190 para 7 min para remover outras células. Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de PBS. Determinar o número de células em uma alíquota da suspensão de células.
2. Spin down quantidade necessária de células em 225 xg por 5 min. Para uma placa de 6 poços 4 x 10 ⁶ células / poço são necessários, portanto, 24 x 10 ⁶ células por placa.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender o CMSP em 1 x 10 ⁶ células / mL em CD40-B meio de cultura fresco suplementado com 50 U / mL de IL-4 como fator de crescimento e 0,63 ciclosporina mcg / mL para evitar A conseqüência de células T (concentrações indicados referem-se a um meio de cultura mL!).
4. Remover o sobrenadante de 6 bem-placa pré-incubadas com tCD40L NIH/3T3 células.
5. Lavar o aderente tCD40L NIH/3T3 células com 2 mL de PBS por poço em primeiro lugar e em uma segunda etapa com 2 mL de CD40-B médio de lavar roupa.
6. Delicadamente adicionar 4 mL de suspensão PBMC (1 x 10 ⁶ células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
7. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO _2.
8. No dia 7, reculture as células (Continue com o 3.2.).

II. Recultivo de CD40 células-B (7 º dia e depois a cada 3-4 dias):

1. Clusters de colheita de células CD40-B a partir de 6 bem-chapa pela ressuspensão com uma pipeta de 10 mL e piscina-los em um tubo de 50 mL.
2. Girar a 225 xg por 7 minutos e substituir completamente o sobrenadante com CD40-B médio de lavar roupa. Contando a quantidade de células de uma alíquota, gire a células para baixo a 225 xg por 5 minutos. Ressuspender as células CD40-CD40-B em B meio de cultura a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / mL.
3. Adicionar novas soluções de interleucina-4 em uma concentração de 50 U / mL e 0,63 ciclosporina mcg / mL A ao meio.
4. Remover o sobrenadante de uma placa de 6 poços de pré-incubadas com tCD40L NIH/3T3 células.
5. Lave as células aderentes com 2 mL de PBS por poço em primeiro lugar e em uma segunda etapa com 2 mL de CD40-B médio de lavar roupa.
6 células / mL) de suspensão CD40-B a cada poço da placa de 6 poços.
6. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO ^2.
7. Células subcultura novamente a cada 3-4 dias para acabar com alta pureza células CD40-B ativadas após um total de 14 dias.

C. Resolução de problemas - O que se as células CD40-B não crescem?

1. Você tem verificado para CD40 ligante expressão de células de alimentação?
2. A placa-bound células alimentadoras usado para a estimulação não deve ser mais de 24h?
3. É uma possível contaminação com micoplasma?
4. Foi a solução interleucina-4 utilizada para a suplementação recém descongeladas e tiveram a atividade biológico adequado?
5. Ciclosporina A foi adicionado na concentração correta?

Figura 1. Por favor, clique aqui para uma versão maior da figura 1.

Figura 2. Por favor, clique aqui para uma versão maior da figura 2.