İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

PBMC insan CD40 aktive B hücreleri üretimi için protokol iki bölüme ayrılmıştır: Kısım A plaka bağlı besleyici hücreler olarak kullanılacaktır NIH/3T3 hücreleri, CD40 ligand ifade hazırlanmasında gösteriyor. Bölüm B, gerçek CD40-B kültür açıklar.

A. besleyici hücreler Hazırlama (tCD40L NIH/3T3)

TCD40L NIH/3T3 tamamen konfluent haline asla yapışkan bir fare fibroblast hücre hattı,. Hücreler bu nedenle haftada iki kez parçalı. Daha fazla 6 hafta içinde Kültürleme tavsiye edilmez.

1. Steril bir pipet ile primer kültür eski orta çıkarın ve 10 ml 1x PBS ile yıkayın hücreleri. PBS ile yıkandıktan sonra aspire.
2. 37 °, 5-10 dakika için 75 ^cm 2 balon 4 ml tripsin / EDTA ° C Hücreleri ayırmak için hafif dokunarak kullanın.
3. Vahşi tip orta 10 ml ekleyin ve hafifçe dönebilen.
4. Hücre süspansiyonu steril bir pipet yardımıyla 50 ml tüp içine aktarın ve 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı döndürün.
5. Süpernatantı ve vahşi tip orta 10 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısı sayın ve uygun sayıda hücre ile üç 50 ml tüpler hazırlamak:
   1. Alt kültüre için 1.5 x 10 ⁶ hücre
   2. 0.2 x 10 ⁶ hücre / CD40 B hücre kültürü için kullanılan ışınlama
   3. dondurmak için geri kalan (gerekirse).
6. 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı spin.
7. Süpernatantı.
   1. Alt kültüre için tekrar süspansiyon 75 cm ² hücre kültürü şişesi 10 ml vahşi tip orta (hücre yoğunluğu 1.5 x 10 ⁵ hücre / ml) 1.5 x 10 ⁶ hücre, G-418 [0.7 mg / ml] ve hücrelerin inkübe % 5 CO ₂ ile 37 ° C. Haftada iki kez hücreleri bölün.
   2. CD40 B hücre kültürü için bir adet 6-plaka için 1.2 x 10 ⁶ hücre gerekir. 0.1 x 10 ⁶ hücre / mL yoğunluğu vahşi tip orta hücrelerin yeniden süspanse edin ve 78 Gy ışın tedavisi. Yanı sıra, her 37 ° inkübe ° C ile% 5 CO ₂ hücre süspansiyonu Plaka 2 mL. TCD40L NIH/3T3 hücreleri yapışık B-hücre uyarılması için hazırlanmış tabak kullanın (en az 4 saat: mikroskop ile bağlılık kontrol edin; B-hücre stimülasyon başlatmak için 24 saat daha beklemek gerekmez). (B. devam)

B. CD 40-B hücre kültürü

CD40 stimülasyon (gün 0) PBMC'ler I. Hazırlık:

Lütfen dikkat: besleyici hücreler yapışık olduğu tespit devam etmeden önce. Interlökin-4 ve siklosporin besi kullanımdan hemen önce taze çözümler her zaman ekleyin.

1. , Taze veya uygun bir şekilde çözülmüş ya PBMC'ler alın. Süspanse edin, iki kez yıkayın ve ilk kez 7 dakika ve diğer hücreleri çıkarmak için ikinci kez 7 dakika süreyle 190 xg'de 265 xg'de aşağı spin 50ml 1x PBS PBMC'ler. Süpernatant atın ve 20 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısını belirler.
2. 5 dakika boyunca 225 xg'de hücrelerin gerekli miktarda aşağı spin. 6 plaka 4 x 10 ⁶ hücre / kuyu, böylece plaka başına 24 x 10 ⁶ hücre ihtiyaç vardır.
3. T-hücrelerinin büyüme faktörü ve 0,63 mg / ml siklosporin gibi bir akıbet önlemek için 1 x 10 ⁶ hücre / ml taze interlökin-4 50 U / ml ile desteklenmiş CD40-B kültür ortamı PBMC tekrar süspansiyon süpernatantı (Verilen konsantrasyonları bir ml kültür ortamı bakın!).
4. Süpernatantı 6-plaka ön tCD40L NIH/3T3 hücreleri ile inkübe.
5. 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık tCD40L NIH/3T3 hücreleri yıkayın.
6. 6-plaka Her iyi yavaşça PBMC süspansiyon 4 ml (1 x 10 ⁶ hücre / ml) ekleyin.
7. 37 hücreleri inkübe ° C ile% 5 CO _2.
8. 7 gün, hücreleri (3.2 ile devam edin.) Reculture.

II. CD40-B hücreleri (7 gün ve daha sonra her 3-4 gün) Recultivation:

1. 50 ml tüp içine 10 ml pipet ve havuz onları resuspending 6-plaka CD40-B hücreleri Harvest kümeleri.
2. 7 dakika boyunca 225 xg'de Spin ve süpernatant tamamen CD40-B yıkama orta yerine. Bir kısım hücre miktarını sayma, 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 1 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyon CD40-B kültür ortamında süspanse edin CD40-B hücreleri.
3. 50 U / ml konsantrasyonu ve 0.63 mg / ml orta siklosporin A interlökin-4 taze çözümler ekleyin.
4. 6 plaka tCD40L NIH/3T3 hücreleri önceden inkübe süpernatantı.
5. 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık hücrelere yıkayın.
10 6 hücre / ml) .
6. 37 ° plakaları inkübe ° C,% 5 ^CO 2 .
7. Altkültür hücreleri yeniden her 3-4 günde bir toplam 14 gün sonra son derece saf bir insan CD40 aktive B hücreleri ile sonuna kadar.

C. Sorun Giderme - CD40-B hücreleri büyümek yoksa?

1. Besleyici hücreler CD40 ligand ifade için kontrol ettiniz?
2. Plaka bağlı uyarılması için kullanılan besleyici hücreler 24 saat daha büyük olması gerekmez mi?
3. Mycoplasma mümkün olan bir kirlenme mi?
4. Interlökin-4 çözüm takviyesi için kullanılan, taze çözülmüş ve uygun biyolojik aktivite vardı?
5. Siklosporin A doğru konsantrasyon eklendi?

Şekil 1: Lütfen burada Şekil 1'de bir büyük versiyonu için tıklayın .

Şekil 2 Lütfen buraya tıklayın Şekil 2 daha büyük bir versiyonu için.