Microinjection तकनीक में सूत्रीविभाजन अध्ययन के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर Syncytial भ्रूण

व्यंजनों:

अंगूर का रस प्लेटें:

• 5.5g bacto अगर
• 14.5 छ डेक्सट्रोज या ग्लूकोज
• 7.15 छ sucrose
• 45 मिलीलीटर अंगूर का रस ध्यान की (100% का रस).
• 204.5 मिलीलीटर ₂ 0 एच
• 625 μl 10N NaOH

उबलते जब तक सभी सामग्री और माइक्रोवेव मिक्स.
2.8 मिलीलीटर एसिड मिश्रण (20.9 मिलीलीटर propionic एसिड, 2.1 मिलीलीटर फॉस्फोरिक एसिड, 27 मिलीलीटर ₂ एच 0 एसिड मिश्रण) जोड़ें

मिश्रण और 35 मिमी पेट्री डिश पर डाल देना. चलो एक या दो दिनों के लिए कमरे के तापमान पर जमना. यदि प्लेटों के लिए जल्द ही इस्तेमाल किया जा नहीं जा रहे हैं, parafilm के साथ सील और 4 बजे रखने डिग्री सेल्सियस (करने के लिए उपयोग करने से पहले आरटी संतुलित अनुमति).

खमीर पेस्ट:

के बारे में खमीर (सिग्मा YSC2, से खमीर Saccharomyces cerevisiae प्रकार द्वितीय) के एक चम्मच पानी में भंग के लिए एक मोटी पेस्ट बनाने के करते हैं. प्रत्येक अंगूर का रस थाली पर इस के छोटे से ठीक पहले राशि उपयोग करने के लिए रखें.

जी पीईएम बफर:

• 80 मिमी ना - पाइप, 6.9 पीएच
• 1 मिमी ₂ MgCl
• 1 मिमी EGTA
• 1 मिमी GTP

इंजेक्शन बफर:

• 150 मिमी K-aspartate
• 10 मिमी कश्मीर फॉस्फेट
• 20 मिमी imidazole, 7.2 पीएच

हेपटैन गोंद:

एक 100ml बोतल में डबल चिपचिपा टेप और जगह उतारना, 50ml हेपटैन के बारे में जोड़ने के लिए, बोतल, कई दिनों के लिए और रॉक सील. जब का उपयोग कर, हेपटैन जोड़ने अगर गोंद भी मोटी है.

निर्जलीकरण चैम्बर:

एक 100 मिमी पेट्री डिश ले लो, एक 35 मिमी पकवान अंदर के एक भाग में डाल करने के लिए एक "तालिका" और इसके आसपास Drierite (निर्जल कैल्शियम सल्फेट) जोड़ने के लिए है कि Drierite की ऊंचाई नहीं है "तालिका" और कवर की तुलना में अधिक है. भ्रूण के साथ coverslip निर्जलीकरण के लिए इस "तालिका" पर इंजेक्शन के समक्ष रखा जाएगा. यह एक अच्छा विचार है करने के लिए कम से कम कुछ संकेत Drierite का उपयोग करें और इसे बदल जब यह रंग बदल गया है.

प्रोटोकॉल:

इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला syncytial भ्रूण में लगभग किसी भी घुलनशील अभिकर्मक के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, या तो अवलोकन या एक लक्ष्य प्रोटीन अवरोध करनेवाला के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या दोनों.

सब कुछ तैयार हो रही है:

1 .- प्रयोग से पहले 2 से 3 दिन, अंगूर का रस प्लेट बनाने के लिए और सेट अप करना पिंजरे: एक प्लास्टिक की बोतल ले लो (6 ऑउंस, एप्लाइड वैज्ञानिक ड्रोसोफिला से दौर नीचे), के विपरीत दिशा में दो छोटे छेद (के ^{बारे में} 1cm 2) में कटौती बोतल और एक कपास टुकड़ा (इस हवा का प्रवाह करने की अनुमति देगा) के साथ भरने, बोतल में मक्खियों नल और एक अंगूर का रस की थाली के साथ कवर. 25 में रखें ° सी (या कमरे के तापमान), मक्खियों के बारे में 10 दिनों के लिए भ्रूण रखना चाहिए.

2 .- कम - से - कम एक दिन पहले प्रयोग इंजेक्शन के लिए सुई खींच, हम एक Kopf सुई / पिपेट डांड़ी 720 मॉडल और पतली दीवारों कांच filaments (विश्व प्रेसिजन उपकरण tw100f) का उपयोग करें. फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन के इंजेक्शन के लिए, 4 पर सुइयों रखने ° सी सुई में तापमान प्रेरित polymerization को रोकने के लिए.

ट्यूबिलिन तैयारी:

नोट: ट्यूबिलिन के साथ सभी काम 4 में किया जाना चाहिए ° सी polymerization को रोकने के लिए.

1. लेबल ट्यूबिलिन फ्रीजर के बाहर ले जाओ और यह 5 से 15 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया.
2. जी पीईएम बफर (4 से 10 गुना आवश्यक तीव्रता के आधार पर) के साथ पतला.
3. 13k rpm पर 4 अपकेंद्रित्र ° सी 10-15 मिनट के लिए.
4. 1 लोड - सुई में 2 μl.

एंटीबॉडी या रासायनिक अवरोध करनेवाला:

ट्यूबिलिन के लिए सुई की तैयारी, एक उपयुक्त एकाग्रता (इस परीक्षण किया जा आवश्यकता हो सकती है) का उपयोग. एंटीबॉडी इंजेक्शन बफर में हो सकता है, जी पीईएम बफर या पीबीएस कर सकते हैं. यदि किसी अन्य बफर की जरूरत है, इस बफर के लिए एक नियंत्रण के रूप में इंजेक्शन हो सकता है यकीन है कि इस बफर अपने दम पर कोई नुकसान का कारण बनता है बनाने की आवश्यकता होगी.

नोट: अवरोध करनेवाला और फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन और मिलाया जा सकता है एक साथ इंजेक्शन अगर सांद्रता यह अनुमति देते हैं. अन्यथा, फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन इंजेक्षन और अवरोध करनेवाला इंजेक्शन लगाने से पहले 5 से 10 मिनट का इंतजार है. जब एक डबल इंजेक्शन प्रदर्शन, और अधिक भ्रूण के साथ शुरू, के बाद से कम भ्रूण आम तौर पर ठीक हो जाएगी.

भ्रूण संग्रह:

1. करना पिंजरे पर एक नई अंगूर का रस थाली रखो.
2. एक घंटे के बाद इस थाली निकालें, यह दिन का पहला संग्रह है और अक्सर बहुत अच्छा नहीं है. यह त्याग किया जा सकता है.
3. प्लेट हर घंटे परिवर्तित करने के लिए एक घंटे के प्रत्येक के लिए इकट्ठा भ्रूण रखने.

Coverslip तैयारी:

1. एक खुर्दबीन स्लाइड के एक तरफ एक 50 x 22mm coverslip रखो. टेप स्लाइड चार कोनों तो यह कदम नहीं करता है.
2. एक कपास का उपयोग applicator के इत्तला दे दी है, एक पंक्ति में coverslip (गोंद चिपचिपा नहीं हो सकता है और कुछ ही सेकंड में सूखी चाहिए, अन्यथा अधिक हेपटैन जोड़ने) पर हेपटैन गोंद की एक परत डाल दिया.
3. का एक टुकड़ा रखोcoverslip के पक्ष की ओर स्लाइड पर चिपचिपा टेप डबल.

भ्रूण तैयारी:

नोट: भ्रूण संग्रह की शुरुआत के बाद 2 घंटे के बारे में imaged किया जाना चाहिए, तो निम्नलिखित चरणों का उन्हें इस समय सीमा के भीतर समाप्त करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति शुरू.

1. एक ब्रश के साथ सिक्त ध्यान अंगूर का रस की थाली और स्लाइड पर जगह डबल चिपचिपा टेप पर से भ्रूण लेने.
2. चिमटी के बाहरी भाग का प्रयोग, डबल चिपचिपा टेप से अधिक भ्रूण रोल जब तक chorion (बाहरी झिल्ली) खुला टूट जाता है.
3. धीरे यह chorion अधिक रोलिंग तो यह चिमटी से नोचना से चिपक और यह भ्रूण coverslip के लंबे पक्ष के लिए समानांतर के लंबे पक्ष के साथ coverslip पर हेपटैन गोंद पर जगह भ्रूण उठाओ. ऊपर एक पंक्ति में 10 से 20 भ्रूण सेट करें.
4. Coverslip निकालें और यह 3 से 8 मिनट (इस कमरे और इंजेक्शन की जाने वाली राशि की नमी पर निर्भर करता है) के लिए निर्जलीकरण के चैम्बर में जगह.
5. वैक्यूम तेल के साथ एक धातु कक्ष पर रखें.
6. हेलोकार्बन तेल 700 के साथ भ्रूण को कवर करने के लिए आगे निर्जलीकरण से बचने के. भ्रूण अब कर रहे हैं इंजेक्शन के लिए तैयार है.

भ्रूण इंजेक्शन:

1. एक 16x उद्देश्य के तहत भ्रूण खोजें.
2. भ्रूण दूर ले जाएँ, और नाभीय विमान चलते बिना सुई खोजने की.
3. केंद्र सुई और यह एक्स या y दिशा में आगे बढ़ बिना कदम है.
4. यदि सुई से खुली नहीं है, देखने के क्षेत्र में coverslip के किनारे डाल दिया, लेकिन सुई नहीं हो सकता है जहाँ, और एक ही फोकल हवाई जहाज़ सुई कम. बहुत ध्यान से coverslip कदम जब तक यह सुई हिट और धीरे टूटता है इसे खोलो. यदि सुई खुला है, तो चरण 5 पर जाएँ. (सुई भरने से पहले Hydrofluoric एसिड के साथ खोला जा सकता है).
5. देखने में भ्रूण (नहीं बल्कि जहां सुई जाएगा) रखो, तेल में सुई कम और सुनिश्चित करें कि आप सुई से अच्छा तरल बूँदें प्राप्त है.
6. लेकिन ध्यान तेजी से सुई में भ्रूण चाल और भ्रूण में एक बूंद इंजेक्षन और भ्रूण दूर ले जाएँ. (या अपने इंजेक्शन तंत्र के निर्देशों का पालन करें).
7. आखिर भ्रूण इंजेक्शन किया गया है, वे एक confocal खुर्दबीन पर निरीक्षण के लिए तैयार हैं.

इमेजिंग:

एक 60 या 100X उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन पर भ्रूण छवि:
नोट:

1. समय अंतराल पर एक समय व्यतीत हो श्रृंखला ज्यादातर के लिए एक कुछ सेकंड में हो सकता है, भ्रूण में समसूत्री विभाजन के बाद से बहुत तेजी से है, सटीक प्रक्रिया के आधार पर अध्ययन किया जा.
2. एक 3 डी श्रृंखला या एक एकल विमान ब्याज की प्रक्रिया के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है.
3. तेजी से अभिनय inhibitors के लिए, इंजेक्शन खुर्दबीन से इमेजिंग खुर्दबीन के लिए स्थानांतरण करने के लिए तेजी से हो गया है.

चित्रा 1: ड्रोसोफिला syncytial भ्रूण में समसूत्री विभाजन की अध्ययन. जल्दी भ्रूण में नाभिक cytokinesis बिना तेजी से डिवीजनों से गुजरना, 13 नाभिक फार्म प्रांतस्था पर एक monolayer के माध्यम से 10 चक्र के दौरान.. जल्दी भ्रूण के प्रांतस्था में नाभिक के साथ योजनाबद्ध. भ्रूण GFP और / या आरएफपी व्यक्त लेबल प्रोटीन कर सकते हैं और अन्य प्रोटीन लेबल और / या inhibitors के साथ microinjected किया जा सकता है है. बी 11 चक्र के लिए GFP-ट्यूबिलिन और आरएफपी - histone सी. पोल पोल जुदाई के प्लॉट व्यक्त भ्रूण के समय चूक इमेजिंग , 12 और एक जंगली प्रकार भ्रूण में 13. तकला लंबाई isometric लंबाई और बढ़ाव की अवधि, जो बहुत सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं की अवधि दर्शाती तकला सूक्ष्मनलिकाएं डी. गतिशीलता. Rhodamine ट्यूबिलिन की कम एकाग्रता इंजेक्शन speckles के कुछ ट्यूबिलिन सब यूनिटों, जो microtubule गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के गठन के लिए होता है.

इस प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, तथापि, हर कदम अभ्यास की आवश्यकता को यकीन है कि भ्रूण को क्षतिग्रस्त नहीं हैं बनाने है. सावधानी से नियंत्रण प्रयोगों हमेशा करने के लिए सुनिश्चित करें कि विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किया जा रहा है के लिए किया जाना चाहिए. GFP-ट्यूबिलिन नियंत्रण व्यक्त करने के लिए सुनिश्चित करें कि पिंजरे का बँटवारा सभी चक्र के माध्यम से सामान्य रूप से भ्रूण सतह (10 13 के माध्यम से चक्र) पर आय बनाने भ्रूण में बफर या rhodamine ट्यूबिलिन microinjecting द्वारा इस शुरू करने के लिए एक अच्छा तरीका है. नियंत्रण भ्रूण में आप spindles के बीच किसी भी शारीरिक कनेक्शन जो अक्सर बहुत ज्यादा निर्जलीकरण के परिणाम हैं का पालन नहीं करना चाहिए, तो निर्जलीकरण समय कम है. जब भ्रूण क्षतिग्रस्त हो रहे हैं, परमाणु नतीजा अक्सर मनाया जाता है, मुफ्त centrosomes या नाभिक या spindles की असमान रिक्ति नुकसान का संकेत कर रहे हैं. पोल पोल दूरी के भूखंड बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और "सफलता" का एक बहुत विश्वसनीय उपाय कर रहे हैं, नियंत्रण भ्रूण में वे संख्या 1 में दिखाया गया है उन लोगों की तरह दिखना चाहिए.

हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है धुरा विधानसभा, रखरखाव और मोनोक्लोनल, पेप्टाइड या पॉलीक्लोनल ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13} ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग बढ़ाव के कई पहलुओं का अध्ययन. विशिष्ट प्रोटीन inhibitors या अन्य रसायनों ब्याज की प्रोटीन को प्रभावित भी और microinjected जा सकता है उनके प्रभाव देखा और मात्रात्मक मापा. एक विशेष अवरोध करनेवाला के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हम निषेध के बाद नियंत्रण भ्रूण में मनाया धुरी लंबाई की तुलना. हम भी का उपयोग प्रतिदीप्त फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन (छवि 1d) की एक कम एकाग्रता के microinjection के ^बाद 14 माइक्रोस्कोपी धब्बा करके ट्यूबिलिन गतिशीलता पर देख सकते हैं .

हम आम तौर पर एक घंटे के लिए इकट्ठा करने और भ्रूण परिपक्व अवलोकन के पहले एक घंटे के लिए चलो, इसका मतलब है कि भ्रूण के बीच 1 और 2 घंटे पुराने हैं जब मनाया. यदि मक्खियों को अच्छी तरह से दे रहे हैं और कई भ्रूण एक घंटे में एकत्र कर रहे हैं, तो संग्रह समय इतना छोटा हो सकता है कि अधिक synchronously - विभाजित भ्रूण प्राप्त कर रहे हैं. यदि निषेध के समय महत्वपूर्ण या अध्ययन करने के लिए ब्याज की है, अवरोध करनेवाला confocal प्रेक्षण के तहत इंजेक्शन जा सकता है. यह कठिन है, लेकिन फिर भी यह संभव है.