Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Rezepte:

Grape Juice Platten:

• 5.5g Bacto-Agar
• 14,5 g Dextrose oder Glucose
• 7,15 g Saccharose
• 45 ml Traubensaft-Konzentrat (100% Saft).
• 204,5 ml H ₂ 0
• 625 ul 10N NaOH

Alle Zutaten mischen und eine Mikrowelle zum Kochen bringen.
Fügen Sie 2,8 ml saure Mischung (Säure-Mix: 20,9 ml Propionsäure, 2,1 ml Phosphorsäure, 27 ml H ₂ 0)

Mix und gießen auf 35 mm Petrischalen. Lassen Sie erstarren bei Raumtemperatur für ein oder zwei Tage. Wenn die Platten sind nicht zu früh eingesetzt werden, mit Parafilm versiegeln und halten bei 4 ° C (allow auf RT, bevor Sie ins Gleichgewicht).

Hefepaste:

Lösen Sie etwa einen Teelöffel Hefe (Sigma YSC2, Hefe aus Saccharomyces cerevisiae Typ II) in Wasser zu einer dicken Paste. Legen Sie eine kleine Menge davon auf jeden Traubensaft Platte kurz vor dem Gebrauch.

G-PEM-Puffer:

• 80 mM Na-Pipes, pH 6,9
• 1 mM MgCl ₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Injektionspuffer:

• 150 mM K-Aspartat
• 10 mM K-Phosphat-
• 20 mM Imidazol, pH 7,2

Heptan Kleber:

Rollen Sie doppelte Klebeband und in eine 100ml Flasche, ca. 50ml Heptan hinzu, verschließen Sie die Flasche, und Rock für mehrere Tage. Bei der Verwendung von, fügen Heptan, wenn der Kleber ist zu dick.

Dehydration Kammer:

Werfen Sie einen 100 mm Petrischale, legte ein Teil einer 35-mm-Schale im Inneren zu einem "table" zu machen und stell Drierite (wasserfreies Calciumsulfat) um ihn herum, so dass die Höhe der Drierite nicht höher ist als der "Tisch" und Deckel. Das Deckglas mit Embryonen werden auf dieser "Tabelle" zur Entwässerung werden vor der Injektion gelegt. Es ist eine gute Idee, zumindest einige der angibt, Drierite verwenden und ändern Sie es, wenn es Farbe hat sich geändert.

Protokoll:

Dieses Protokoll kann die Injektion von praktisch jeder lösliche Reagenz in die Drosophila-Syncytial-Embryo eingesetzt werden: Zum Beispiel, entweder ein fluoreszierendes Protein zur Beobachtung oder ein Zielprotein Hemmer oder beides.

Getting alles bereit:

1 .- 2 bis 3 Tage vor Experiment machen Traubensaft Platten und richten Sie legen Käfig: Nimm eine Plastikflasche (6 oz, runder Boden von Applied Scientific Drosophila), schneiden Sie zwei kleine Löcher (ca. 1cm ²⁾ auf gegenüberliegenden Seiten des Flasche füllen und mit einem Baumwolltuch Stück (dies wird damit die Luft flow), tippen Sie auf die Fliegen in die Flasche geben und mit einem Traubensaft Platte. Halten bei 25 ° C (oder Raumtemperatur), sollten fliegt Embryonen für etwa 10 Tage liegen.

2 .- Mindestens ein Tag vor dem Experiment von Nadeln zur Injektion ziehen, verwenden wir einen Kopf Nadel / Pipette Puller Modell 720 und dünnwandigen Glasfasern (World Precision Instruments tw100f). Für die Injektion von fluoreszierenden Tubulin, halten Nadeln bei 4 ° C auf Temperatur-induzierte Polymerisation in der Nadel zu verhindern.

Tubulin Vorbereitung:

Hinweis: Alle arbeiten mit Tubulin sollte bei 4 ° C, um die Polymerisation zu verhindern.

1. Nehmen gekennzeichnet Tubulin aus der Tiefkühltruhe und legte es auf Eis für 5 bis 15 Minuten.
2. Verdünnen mit G-PEM-Puffer (4 bis 10 fach je nach Intensität erforderlich).
3. Zentrifuge bei 13k rpm bei 4 ° C für 10-15 Minuten.
4. Legen Sie 1 bis 2 ul in Nadel.

Antikörper oder chemische Inhibitor:

Bereiten Nadeln für Tubulin, mit einer geeigneten Konzentration (dies kann geprüft werden müssen). Der Antikörper kann in Injektionspuffer werden, G-PEM-Puffer oder PBS. Wenn ein anderer Puffer erforderlich ist, wird dieser Puffer müssen als Kontrolle injiziert werden, um sicherzustellen, dass dieser Puffer verursacht keine Schäden am eigenen.

Hinweis: Inhibitor und fluoreszierende Tubulin können gemischt und gemeinsam, wenn die Konzentrationen es ermöglichen injiziert. Ansonsten injizieren das fluoreszierende Tubulin und warten 5 bis 10 Minuten vor Injektion des Inhibitors. Bei der Durchführung einer doppelten Einspritzung, mit mehr Embryonen zu starten, da weniger Embryonen in der Regel erholen wird.

Embryo-Entnahme:

1. Legen Sie eine neue Traubensaft Platte auf die Gestaltung Käfig.
2. Entfernen Sie diese Platte nach einer Stunde, das ist die erste Kollektion des Tages und oft nicht sehr gut. Es kann verworfen werden.
3. Ändern Sie den Teller pro Stunde zu sammeln Embryonen für jeweils eine Stunde zu halten.

Deckglas Zubereitung:

1. Setzen Sie ein 50 x 22mm Deckglas auf der einen Seite einen Objektträger. Kleben Sie die vier Ecken, um die Folie, damit es nicht zu bewegen.
2. Mit einem Wattestäbchen, legte eine Schicht aus Heptan Leim in einer Zeile auf dem Deckglas (der Kleber sollte nicht viskos und sollte in ein paar Sekunden trocknen, sonst fügen Sie mehr Heptan).
3. Legen Sie ein StückDoppel-Klebeband auf der Folie auf der Seite des Deckglases.

Embryo Zubereitung:

Hinweis: Die Embryonen etwa 2 Stunden nach Beginn der Sammlung abgebildet werden sollen, so beginnen die folgenden Schritte ausreichend Zeit, um sie innerhalb dieses Zeitrahmens zu beenden.

1. Mit einem feuchten Pinsel vorsichtig abholen Embryonen aus dem Traubensaft Platte und am Doppel-Klebeband auf dem Objektträger.
2. Mit den äußeren Teil der Pinzette, rollen die Embryonen in den Doppel-Klebeband bis zum Chorion (die äußere Membran) bricht.
3. Pick-up der Embryo durch ihn sanft über das Chorion dass es auf die Pinzette Stöcken und legen Sie es auf dem Heptan Kleber auf das Deckglas mit der langen Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Deckglases. Set up von 10 bis 20 Embryonen in einer Zeile.
4. Entfernen Sie das Deckglas und legen Sie sie in die Dehydratisierung Kammer für 3 bis 8 Minuten (dies hängt von der Luftfeuchtigkeit des Raumes und der Menge, die injiziert werden).
5. Auf ein Metall-Kammer mit Vakuum-Fett.
6. Decken Sie die Embryonen mit Halocarbonöl 700 bis Vermeidung weiterer Austrocknung. Embryonen sind nun bereit für die Injektion.

Embryo-Injektion:

1. Finden Sie die Embryonen unter einem 16x Objektiv.
2. Bewegen Sie den Embryonen entfernt, und finden Sie die Nadel ohne Verschieben der Fokusebene.
3. Zentrieren Sie die Nadel aus und verschieben ihn, ohne es in x oder y-Richtung.
4. Wenn die Nadel nicht geöffnet ist, legen Sie die Kante des Deckglases in das Blickfeld, aber nicht dort, wo die Nadel sein wird, und senken Sie die Nadel auf die gleiche Bildebene. Sehr vorsichtig bewegen das Deckglas, bis sie die Nadel Hits und sanft bricht sie zu öffnen. Wenn die Nadel zu öffnen, gehen Sie zu Schritt 5 fort. (Nadeln können mit Flusssäure vor der Befüllung geöffnet werden).
5. Legen Sie die Embryonen in Aussicht (aber nicht, wo die Nadel wird), senken Sie die Nadel in die Öl-und vergewissern Sie erhalten schöne Flüssigkeitstropfen von der Nadel.
6. Vorsichtig, aber stetig bewegen den Embryo in die Nadel und Injektion ein Tropfen in den Embryo und bewegen Sie den Embryo entfernt. (Oder folgen Sie den Anweisungen Ihres Injektionsgeräts).
7. Schließlich wurden die Embryonen injiziert worden, sind sie bereit für die Beobachtung an einem konfokalen Mikroskop.

Imaging:

Bild der Embryonen auf einem konfokalen Mikroskop mit einer 60 oder 100X Objektiv:
Notes:

1. Der zeitliche Abstand auf einer Zeitserie sollte höchstens ein paar Sekunden, da die Mitose in der Embryo ist sehr schnell, je nach den genauen Ablauf zu untersuchen.
2. Eine 3D-Serie oder eine einzelne Ebene kann je nach Verfahren von Interesse erworben werden.
3. Für schnell wirkende Inhibitoren, hat die Übertragung von Injektion Mikroskop Imaging-Mikroskop, schnell zu sein.

Abbildung 1: Studium der Mitose in der Drosophila-Syncytial-Embryo. Kernen im frühen Embryo zu unterziehen schnellen Divisionen ohne Zytokinese, während der Zyklen 10 bis 13 Kerne bilden eine Monoschicht an der Hirnrinde. A. Schematische Darstellung des frühen Embryos mit Kernen bei Cortex. Embryo ausdrücken können GFP und / oder RFP markierten Proteine ​​und kann mit anderen markierten Proteine ​​und / oder Inhibitoren mikroinjiziert werden. B. Zeitraffer-Aufnahme von Embryos, die GFP-Tubulin-und RFP-Histon. C. Plot des Pol-Pol-Trennung für Fahrräder 11 , 12 und 13 in einem Wildtyp-Embryo. Spindellänge Exponate Perioden der isometrischen Länge und Perioden der Dehnung, die sehr konstant und reproduzierbar sind. D. Dynamik der Spindel Mikrotubuli. Die Injektion von geringen Konzentration von Rhodamin Tubulin führt zu Flecken von wenigen Tubulin-Untereinheiten, die verwendet werden, um die Dynamik der Mikrotubuli-Studie kann gebildet.

Dieses Protokoll ist relativ einfach, aber jeder Schritt der Praxis erfordert, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht beschädigt werden. Sorgfältige Kontrolle Experimente brauchen immer zu tun, um sicherzustellen, dass zuverlässige Ergebnisse zu erhalten werden. Ein guter Weg, dies zu beginnen, ist durch Mikroinjektion Puffer oder Rhodamin Tubulin zu kontrollieren Embryonen, die GFP-Tubulin, um sicherzustellen, dass die Mitose in der Regel durchläuft alle Zyklen bei dem Embryo Oberfläche (Zyklen 10 bis 13). In der Kontrollgruppe Embryonen sollten Sie nicht beobachten physikalische Verbindungen zwischen Spindeln, die oft das Ergebnis von zu viel Dehydration, so geringer ist die Austrocknung der Zeit. Wenn Embryonen geschädigt sind, nuklearen Fallout oft beobachtet wird, sind frei Zentrosomen oder unebene Abstand der Kerne oder Spindeln Anzeichen für Beschädigungen. Grundstücke Pol-Pol-Abstand sind sehr gut reproduzierbar und sind ein sehr zuverlässiges Maß für "Erfolg", die Kontrolle Embryonen sollten sie wie in Abbildung 1 dargestellt aussehen.

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um viele Aspekte der Spindel Montage, Wartung und Dehnung mit monoklonalen, Peptid-oder polyklonale Antikörper gegen das Protein von Interesse ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13} angehoben studieren. Spezifische Protein-Inhibitoren oder anderen Chemikalien, die die Protein von Interesse kann auch mikroinjiziert und deren Auswirkungen beobachtet und quantitativ gemessen. Zur Beurteilung der Wirkung eines bestimmten Inhibitor, vergleichen wir Spindellänge nach Hemmung zu, dass die Kontrolle Embryonen beobachtet. Wir können auch bei Tubulin Dynamik Blick durch Fluorescent Speckle Microscopy ¹⁴ nach Mikroinjektion von einer niedrigen Konzentration von fluoreszierenden Tubulin (Abb. 1d).

Wir in der Regel für eine Stunde zu sammeln und lassen Embryonen reifen für eine weitere Stunde, bevor Beobachtung, bedeutet dies, dass Embryonen zwischen 1 und 2 Stunden alt sind, wenn beobachtet. Wenn die Fliegen gut sind die Verlegung und viele Embryonen werden in einer Stunde abgeholt, dann ist die Abholzeit kann so verkürzt werden, dass mehr synchron teilenden Embryonen gewonnen werden. Wenn das Timing der Hemmung ist von entscheidender Bedeutung oder von Interesse für die Studie, kann der Inhibitor unter konfokale Beobachtung injiziert werden. Das ist schwieriger, aber es ist trotzdem möglich.