Биолюминесценция Визуализация гемоксигеназы-1 регуляция в порядке Гуа Ша

1. Женский HO-1-люциферазы трансгенных мышей (возраст 4-6 недель) можно приобрести у Taconic Фермы, Inc Прибыв на место, мышь помещают в центр содержания животных в течение 4 дней, чтобы жилье.
2. Подготовка к биолюминесценции изображений:
   1. Взвесьте каждый HO-1 мыши. Животное весом, необходимых для расчета дозы люциферин.
   2. Удаление волос: Используйте хлопок подкачки применять для удаления волос Наир ® на животе и / или задней части животного. Ожидание от 5 до 10 секунд. Используйте чистую своп хлопка, чтобы вытереть волосы. Опустите кусок ткани в дистиллированной воде для чистки оставшихся волос.
   3. Место не-люминесцентные черная бумага (Strathmore Artagain ® черной бумагой) на изображения платформе ИВИС 100 станции снизить фоновый шум.
   4. Подготовка люциферин (от Xenogen Corporation) раствора при концентрации 7,5 мг / мл (растворяется в стерильной H ₂ O). Доза люциферин является 65,5 мг / кг массы тела. Таким образом, 20 грамм мыши требует при введении препарата в 0,175 мл раствора люциферин. Чтобы достичь этого, один том инъекции люциферин решение (0.175ml) загружена на шприц с 26-иглы
3. Гуа Ша процедуры: Гуа Ша применяется только один раз перед запуском протокола биолюминесценции изображений. С Гуа Ша это совсем не больно, мышь нужно только быть кратко анестезии по изофлуран сохранять спокойствие. Гуа Ша процедура включает в себя следующие этапы:
   1. Применять растительное масло или дистиллированную воду, чтобы смазать участки кожи мишенью Гуа Ша несколько раз во время процедуры Гуа Ша.
   2. Повторно очистить волосы без область спины мыши в мягкий, но фирма силы с помощью керамической ложкой супа или пластмассовой ложкой.
   3. Выскабливание продолжается, пока обратно кожа становится красной, что является признаком экстравазации крови подкожно, обычно достигается в течение 2 до 3 минут.
4. Биолюминесценция визуализации может быть начата немедленно или через несколько часов после Гуа Ша как HO-1 регуляция строится медленно, в течение нескольких часов. Процедура биолюминесценции визуализации:
   1. Анестезию мыши в камере анестезии индукции заполнены смесью изофлуран (1,5%) и медицинского класса воздух.
   2. Как только мышь под наркозом, подведите курсор к визуализации камеры на ИВИС 100 оптических станций визуализации. Поместите мышь в лежачем положении (живот вверх). Камеры изображений постоянно переплетаются с 1,5% изофлуран. Визуализации платформы нагревают при 37 ° C держать мышь теплым.
   3. Установить изображение на приобретение "средний биннинга" и установить время экспозиции составляет 30 секунд. Начать можно получить изображения. Установить машину, чтобы повторить изображений приобретение каждые три минуты, либо вручную, либо автоматически. После приобретения первого изображения, области интереса (ROI) обращается на покрытие брюшной полости, грудной клетки и области головы. Это ROI затем скопировать и вставить на следующие изображения с помощью "живой образ ®", программное обеспечение сопровождающих ИВИС 100 станции.
   4. Интенсивность сигнала измеряется в фотонов в секунду. Марка время интенсивность сигнала достигнуть своего пикового значения и держать на изображение мышь от 5 до 10 минут после пиковое время.
   5. При приобретении изображений в положении лежа на спине не будет сделано, переверните мышь и положите его в положении лежа (резервное копирование). Продолжить изображениями животных от 5 до 10 минут с ROI сейчас обращено на крышку назад и глава области, в использовании программного обеспечения "живой образ ®". Выбор изображений положении лежа после лежачем положении произвольно. Можно выбрать, чтобы начать с положения лежа, в зависимости от первичных органов, представляющих интерес. Другим вариантом является изображение на спине и склонны позиции на отдельных экспериментов.
   6. При приобретении изображений в положении лежа закончится, выключите изофлуран и перемещать мышь от изображений камеры индукции камеру, чтобы оправиться. Индукции камеры теперь переплетаются с медицинскими воздух только и мыши обычно просыпается менее чем за одну минуту.
   7. Сохранить образа данных для последующей обработки.
   8. После первоначального изучения изображений, дополнительных приобретений изображений осуществляется в течение нескольких дней после Гуа Ша. Один образец график повторяется изображение на ^12-й час, ^24-й час, ^36-й час, ^48-й час, 72 ^час-й и ^120-й час, но точные сроки графика визуализации является гибким. Дополнительные сессии визуализации может быть учтен при длительный период наблюдения не требуется. Перед изображения, повторите процедуру удаления волос если волосы обратно не выросли.
5. Для контрольной группы, повторите всю процедуру, но пропустить Гуа Ша (шаг 3). Если же группа мышей используется как для контроля и Гуа Ша, контроль ехрeriment должна осуществляться предпочтительно перед процедурой Гуа Ша или, по крайней мере, один месяц после этого.

Представитель Результаты:

Биолюминесценции изображения на рисунке 1, показывают, в естественных условиях регуляция HO-1 в ответ на Гуа Ша. График на рисунке 2 представлены количественные временного изменения более 120 часов в оптический поток (фотонов / сек) от всего тела той же мыши, связанные с Гуа Ша ...

Рисунок 1. Слева направо, представитель образы вид спереди (спине) одного и того же мыши до Гуа Ша, в 18 часов, 36 часов и 120 часов после Гуа Ша, соответственно. После Гуа Ша, наблюдается прогресс значительное увеличение интенсивности сигнала в нескольких органов, которые охватывают регионы желудочно-кишечного тракта, половых путей, печени, почек (с обратной точки зрения, не показан), и другие. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения фигуры 1.

Рисунок 2. Количественные изменения потока (фотонов / сек) от всего тела гусеничных более 120 часов после Гуа Ша в той же мыши на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.

Транскрипция HO-1, индуцибельной формы гемоксигеназы, является upregulated от многих факторов, включая гема, перекись водорода, УФ-облучение, гипоксия и физические стрессы. Всего изображений тела, такие как сообщили HO-1 биолюминесценции протокол обеспечивает быстрый снимок системного HO-1 выражение в различных органах. В небольших животных, биолюминесценции изображения позволяет с высокой чувствительностью в естественных условиях в режиме реального времени количественных продольных оптических оценки изменений в системный экспрессии генов, как показано на рисунке. Биолюминесценция молекулярной визуализации снижает стоимость и увеличивает пропускную способность экспрессии генов анализы у мелких животных, что делает его практичным быстро достичь статистической мощности, необходимой для исследования сложных гипотез системной биологии и для оценки системного действия предлагаемой фармацевтической и других терапевтических мероприятий. Одним из ограничений является низкое пространственное разрешение анатомии. Новые оптические системы визуализации, которые имеют возможность томографической смягчило бы проблему. Приобретение изображения и регистрация по микро-КТ или МРТ маленькое животное поможет правильно определить анатомию. Другие ограничения являются низкий уровень проникновения света сквозь ткани и необходимость трансгенных животных. Эти по существу исключает перевод на более крупных животных или использования человеком, но не являются существенным недостатком для небольших животных системной биологии или доклинических терапевтической проверки гипотезы.