Biolumineszenz-Bildgebung von HO-1 Hochregulation in der Gua Sha Procedure

1. Weibliche HO-1-Luciferase transgenen Mäusen (Alter von 4-6 Wochen) von Taconic Farms, Inc. kann bei der Ankunft erworben werden, sind Mäuse in ein Tier Wohnanlage für mindestens 4 Tage platziert, um Unterkunft zu ermöglichen.
2. Vorbereitung für die Biolumineszenz-Bildgebung:
   1. Wiegen Sie jedes HO-1-Maus. Tierische Gewicht ist für die Berechnung der Dosierung von Luciferin erforderlich.
   2. Haarentfernung: Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Haarentferner Nair ® über den Bauch und / oder Rücken des Tieres gelten. Warten auf 5 bis 10 Sekunden. Verwenden Sie ein sauberes Wattestäbchen abzuwischen Haar. Tauchen Sie ein Stück Gewebe in destilliertem Wasser zu reinigen restlichen Haare zu wischen.
   3. Legen Sie eine nicht-fluoreszierenden schwarzem Papier (Strathmore Artagain ® schwarzes Papier) auf dem Imaging-Plattform eines IVIS 100 Rufnummer um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
   4. Bereiten Luciferin (von Xenogen Corporation)-Lösung mit einer Konzentration von 7,5 mg / ml (gelöst in sterilem H ₂ O). Die Dosis von Luciferin bei 65,5 mg / kg Körpergewicht. So erfordert ein 20-Gramm-Maus intraperitoneale Injektion von 0,175 ml Luciferin-Lösung. Um dies zu erreichen, ist eine einmalige Injektion Volumen von Luciferin-Lösung (0.175ml), um eine Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel vorinstalliert
3. Gua Sha Verfahren: Gua Sha ist nur einmal vor der Ausführung des Biolumineszenz-Bildgebung Protokoll angewendet. Da Gua Sha ist nicht schmerzhaft, muss die Maus nur zu kurz betäubt durch Isofluran, ruhig zu bleiben. Gua Sha Verfahren umfasst folgende Schritte:
   1. Bewerben Speiseöl oder destilliertem Wasser auf Hautbereiche durch Gua Sha gezielt ein paar Mal während der Gua Sha Verfahren zu schmieren.
   2. Wiederholt kratzen die Haar-freie Region der Rückseite der Maus in sanfte, aber feste Kraft mit einer keramischen Suppenlöffel oder einem Plastiklöffel.
   3. Das Schaben wird fortgesetzt, bis der Rücken Haut rot wird, ist das ein Zeichen der subkutanen Blutextravasat, in der Regel innerhalb von 2 bis 3 Minuten erreicht.
4. Biolumineszenz-Bildgebung kann sofort oder einige Stunden nach Gua Sha gestartet werden als HO-1 Hochregulation wird langsam über einige Stunden hinweg gebaut. Das Verfahren für die Biolumineszenz-Bildgebung ist:
   1. Anesthetize der Maus in einer Narkose Kammer mit einer Mischung aus Isofluran (1,5%) und medizinischem Luft gefüllt.
   2. Sobald die Maus narkotisiert, bewegen Sie die Maus, um die Imaging-Kammer auf der IVIS 100 optische Bildgebung Station. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage (Bauch nach oben). Die Imaging-Kammer wird kontinuierlich mit 1,5% Isofluran infundiert. Die Imaging-Plattform wird bei 37 ° C erhitzt, damit die Maus warm.
   3. Stellen Sie die Imaging-Akquisition "medium Binning" und die Belichtung auf 30 Sekunden sein. Start, um Bilder zu erwerben. Stellen Sie das Gerät zu wiederholen Imaging Acquisition alle drei Minuten, entweder manuell oder automatisch. Nach dem Erwerb des ersten Bildes, ist eine Region of Interest (ROI) erstellt, die Bauch-, Brust-und Kopfbereich zu decken. Diese ROI wird dann kopiert und eingefügt, um die folgenden Bilder mit "Living Image ®", Software begleitenden IVIS 100 Rufnummer.
   4. Die Signalintensität ist in Photonen pro Sekunde gemessen. Mark Zeit für die Signalintensität zu erreichen ihren Höhepunkt Wert und halten auf die Bildgebung mit der Maus für etwa 5 bis 10 Minuten nach dem Peak-Zeit.
   5. Wenn die Imaging Acquisition bei der Rückenlage geschehen ist, drehen Sie die Maus über und legen Sie sie in der Bauchlage (back up). Weiter Bildgebung das Tier für 5 bis 10 Minuten mit dem ROI jetzt gezogen, um die Rücken-und Kopfbereich in die Nutzung der Software "Living Image ®" zu decken. Die Wahl der Bildgebung der Bauchlage nach der Rückenlage ist beliebig. Man kann wählen, um mit der Bauchlage beginnen, abhängig von der primären Organe von Interesse. Eine weitere Option ist zur Abbildung der Rücken-und Bauchlage auf getrennten Experimenten.
   6. Wenn die Imaging Acquisition bei der Bauchlage beendet ist, schalten Sie Isofluran und bewegen Sie die Maus aus dem Imaging-Kammer zur Induktion Kammer sich zu erholen. Die Induktion Kammer wird nun mit medizinischer Luft nur die Maus in der Regel wacht in weniger als einer Minute infundiert.
   7. Speichern von Bilddaten für die Nachbearbeitung.
   8. Nach der ersten Imaging-Studie, sind zusätzliche bildgebende Akquisitionen für mehrere Tage nach Gua Sha durchgeführt. Eine Probe Zeitplan Bildgebung an der 12 ^th Stunde, 24 ^th Stunde, 36 ^th Stunden, 48 ^th Stunde ^72. Stunde und ^120. Stunde wiederholt, aber der genaue Zeitpunkt der Bildgebung Zeitplan ist flexibel. Zusätzliche Imaging-Sitzungen können hinzugefügt werden, wenn eine längere Follow-up benötigt wird. Vor Bildgebung, wiederholen Sie die Haare entfernen Verfahren, wenn die Haare wieder gewachsen ist.
5. Für die Kontrollgruppe, wiederholen Sie alle Verfahren, sondern überspringen Gua Sha (Schritt 3). Wenn die gleiche Gruppe von Mäusen ist sowohl für Steuerungs-und Gua Sha, der Steuerung exp verwendeteriment sollte vorzugsweise vor dem Gua sha Verfahren durchgeführt oder mindestens einen Monat danach.

Repräsentative Ergebnisse:

Die Biolumineszenz Bilder in Abbildung 1 zeigen in vivo Hochregulation von HO-1 in Reaktion auf Gua Sha. Der Graph in Abbildung 2 zeigt die quantitative zeitliche Änderung mehr als 120 Stunden im optischen Fluss (Photonen / sec) aus dem ganzen Körper die gleiche Maus im Zusammenhang mit Gua Sha ...

Abbildung 1. Von links nach rechts, repräsentative Bilder der Frontansicht (Rückenlage) der gleichen Maus vor Gua Sha, bei 18 Stunden, 36 Stunden und 120 Stunden nach der Gua Sha, jeweils. Nach Gua Sha, beobachtet man den Fortschritt der signifikante Anstieg der Signalintensität mehrere Organe, die Regionen des Magen-Darm-Trakt, im Genitalbereich, die Leber, Nieren (von hinten sehen, nicht gezeigt), und andere umfassen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1.

Abbildung 2. Quantitative Flussänderung (Photonen / sec) aus dem ganzen Körper über 120 Stunden verfolgt folgende Gua Sha in der gleichen Maus von Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

Transkription von HO-1, eine induzierbare Form von Häm-Oxygenase, wird von vielen Faktoren ab, einschließlich Häm, Wasserstoffperoxid, UV-Bestrahlung, Hypoxie und körperlichen Belastungen hochreguliert. Ganzkörper-Bildgebung, wie die gemeldeten HO-1 Biolumineszenz-Protokoll bietet einen schnellen Überblick über systemische HO-1-Expression in mehreren Organen. Bei Kleintieren erlaubt Biolumineszenz-Bildgebung mit hoher Empfindlichkeit in-vivo Echtzeit quantitative Längs-optische Beurteilung der Veränderungen in der systemischen Genexpression, wie gezeigt. Biolumineszenz molekulare Bildgebung senkt die Kosten und erhöht den Durchsatz der Genexpression-Assays in kleine Tiere, so dass es praktisch, schnell zu erreichen die statistische Power für die Untersuchung komplexer Systeme Biologie Hypothese benötigt werden, und für systemische Wirkungen der vorgeschlagenen pharmazeutischen und anderen therapeutischen Interventionen zu bewerten. Eine Einschränkung ist geringer räumlicher Auflösung der Anatomie. Neuere optische bildgebende Systeme, die tomographischen Fähigkeit hätte das Problem zu lindern. Bilderfassung und Registrierung von Mikro-CT-oder Kleintier-MRT helfen würde, zur Identifizierung der Anatomie. Weitere Einschränkungen sind gering Lichteinfall durch das Gewebe und die Notwendigkeit von transgenen Tieren. Diese im Wesentlichen entgegen, Übersetzung, um größere Tiere oder den menschlichen Gebrauch, sind aber nicht einen erheblichen Nachteil für kleine Tier Systembiologie oder präklinische therapeutische Hypothesentests.