Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Yang, Z., Zeng, Q., Ma, Z., Wang, Y., Xu, X. Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging. J. Vis. Exp. (31), e1388, doi:10.3791/1388 (2009).

Musküler distrofiler kontraktil kas hücrelerinin progresif kaybı ile karakterize dejeneratif kas hastalıklarının bir grup. Şu anda herhangi bir iyileştirici bir tedavi yoktur. Kök hücre biyolojisi son gelişmeler bu hastalıkları tedavi etmek için etkili bir hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesi için yeni umutlar yarattı. Distrofik hayvan modelleri kas içine floresan proteinleri ile etiketlenmiş kök hücrelerin çeşitli türleri Nakli alanında geniş anlamda kullanılmıştır. Nakledilen hücre kaderi takip etmek yeteneğine sahip bir non-invaziv bir tekniktir boyuna, daha doğru ve verimli bir şekilde nakledilen hücrelerin kas engraftman değerlendirmek için yetenek daha.

Bu çalışmada, in vivo floresan görüntüleme nakledilen GFP (Yeşil Floresan Protein) etiketli fare iskelet kaslarında hücre izlemek için duyarlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir. Floresan protein uyarma için gerekli harici bir ışık kullanımı nedeniyle geçmişi hakkında endişe rağmen, çıplak ya da fareyi kullanarak ya da epilasyon reaktifler saç ortadan kaldırarak çok bu sorunun ortadan olduğu bulundu. CCD kamera kullanarak, floresan sinyal GFP transgenik fareler veya eGFP transduced myoblast kültür ya da 5 x 10 ⁵ hücre enjeksiyonu sonra tibialis anterior kas (TA) tespit edilebilir. Ekstansör digitorum longus (EDL), daha az hücre enjeksiyonu gibi daha yüzeysel kasları için saptanabilir bir sinyal üretir. Sinyal yoğunluğu ölçülür ve ilgi (ROI) bir bölgede saniyede fotonların sayısı olarak sayılabilir olabilir. Edinilen görüntüleri engrafted alan net sınırlarının çizilmesi, ROI boyutu olarak ölçülebilir. Bacaklarda sürekli her zaman konumda iseniz, kas ve ROI boyutu başına saniyede fotonların toplam sayısı değişiklikler engrafted hücrelerinin sayısında değişiklikler ve engrafted alanının boyutunu yansıtmaktadır. Bu nedenle zaman içinde aynı kas değişiklikleri ölçülebilir. In vivo floresan görüntüleme tekniği tumorogenic hücrelerinin büyümesini izlemek için öncelikle kullanılan olmuştur, bizim çalışmamızda, nakledilen kök hücrelerin kaderi takip etmek için bize sağlayan güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.

Hücre hazırlık

1. Uydu hücre izolasyonu
   1. Anestezi altında, GFP transgenik fareler (C57BL / Ka-βactin-EGFP) bacak kasları kaldırılır. Küçük parçalar halinde kestikten sonra, uydu hücreler 37 1 saat süreyle% 2 dispase kollajenaz çözümü ile kıyılmış doku kuluçka ° C enzimatik ayrışmış
   2. Ham F-10 ve% 20 FBS içeren büyüme medya ile enzim sindirimi nötralize Pasteur pipeti ile tekrar triturating kas ayrıştırmaları. Hücreleri hücre süzgecinden geçirilerek süzülür (Ø70-100μm) ve ardından 37 az 1 saat kaplı olmayan bir yemek ° C kaplama
   3. Kollajen kaplı bir çanak süpernatant ve plaka onları hafifçe kaldırın. Matür arındırmak için bu adımı daha sonra 1 saat tekrarlayın. (Ön plaka)
   4. Zaman içinde medya ve plaka hücrelerin değiştirin. Son saflaştırılmış matür orta Ham F-10,% 20 FBS, 100 U / ml penisilin ve 37 ° C,% 5 CO2,% 95 hava az 100 mcg / ml streptomisin (besi) içeren kültür.
   
   
2. Kültür ve 10 ng / ml temel FGF ilavesi ile büyüme ortamında birincil matür genişletmek.
3. In vivo deneyler için, TA kas başına 5x10 ⁵ hücre enjekte edilir.
4. Matür hasat,% 0.25 'lik tripsin / EDTA kullanarak hücreleri ayırmak ve iki kez PBS ile yıkayın. Hücre sayıları bir hemasitometre sayılır ve hücreleri 5x10 ⁴ hücre / ml 'lik bir konsantrasyon HBSS yeniden bekletildi. HBSS içinde buz üzerinde konsantre hücreleri yerleştirilir ve toplandıktan sonra 1 saat içinde enjekte edilir.

Vivo Görüntüleme

1. 4-6 haftalık yaşta Erkek mdx farelerin Jackson laboratuvarı satın alınan ve bir hayvan barınağı tesiste muhafaza edilir.
2. Çevre konaklama yaklaşık bir hafta sonra, farelerin kültür hücreleri ile implante olmaya hazır.
3. Hücre nakli öncesinde, fare karışımı Ketamin (100 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi. Sonra TA kas alanı çevresinde saç bacak için Nair ve distile su ile silerek temizleyin uygulayarak 30 saniye bekliyor kaldırılır.
4. Fare anestezi altında iken, 5x10 ⁵ hücre 10μl HBSS 30 gauge iğne kullanılarak 3 puan yavaş yavaş her TA kas içine enjekte edilir .
5. 4. adımı sonra, fare, in vivo floresan görüntüleme tarafından düzenli olarak görüntülü olabilir . Yüksek duyarlı şarj çiftli kamera ile donatılmış floresan görüntüleme istasyonu Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), Farelerin engel bacak görüntüler elde etmek için kullanılır.
6. In vivo görüntüleme gününde, ilk olarak saç regrowth TA kas kontrol edin. Gerekirse, biz fareyi Ketamin ve Xylazine karışımı ile anestezi sonrası, yukarıda açıklandığı gibi saç kaldırmak için Nair yeniden uygulayın.
7. Fare anestezi altında iken, fare siyah floresan olmayan kağıt (Strathmore siyah Artagain kağıt) bir parçası üzerinde yüzükoyun pozisyonda yerleştirin. TA kas daha iyi görüntüleme için tam göstermek için, kağıt arka pençeleri bantlayın.
8. Biz görüntüleme odası ve konumu, kameranın görüş alanının merkezinde görüntülü arka bacak fare yer. Biz ilk 5 saniyelik bir pozlama süresi ile bacak geleneksel bir gri-ölçekli fotoğraf görüntü almak için emisyon filtresi anahtarı. Fare ve gerekirse kameranın odak konumunu yeniden ayarlayınız. Pozlama süresi (1250 ms), örnek yüksekliği (0.9 cm) vb de dahil olmak üzere görüntüleme parametreleri deneysel süreç içinde sabit tutulur.
9. Daha sonra yeşil flüoresan protein dalga boyu için uygun emisyon filtresi anahtarı. Biz 1.250 ms ve 1 binning maruz kalma süresi ile floresan görüntü alır. Görüntüleme sonra, fare toparlanma beklemek için bir kafes görüntüleme odasından çıkarılır.
10. Analizi için, saniyede fotonların açısından yoğunluğunu ölçmek için floresan sinyalleri üzerinde bir ilgi bölgesi (ROI) çizin. Biz de başka bir ölçüm değeri olarak piksel sayısı açısından yatırım getirisini ölçmek. Görüntüleme deneyler, boylamsal veri elde etmek için, gerekirse bir kaç ay içinde her hafta daha sık tekrarlanan ya da olabilir.

Deney sonunda, fare ötenazi ve TA kas histolojisi analizi için hasat edilir.

Biz bu çalışmada ana iskelet kası floresan etiketli nakledilen hücrelerin izlemek için güvenilir ve istikrarlı bir görüntüleme platformu kurdu. GFP transgenik fare GFP etiketli matür yetişkin kök hücreler gelecekte hücre tedavisi için aday olacak bir tür için duruyor. Hücre sayısı, hücre enjeksiyonu, açık arka plan, görüntüleme konumunu ve makine parametresi de dahil olmak üzere sürekli bir manipülasyon, yüksek kalitede görüntü elde ve özellikle kantitatif analiz için önemlidir.

Floresans görüntüleme non-invaziv, kolay olduğu gibi biyomedikal araştırmalarda birçok uygulamalar vardır ve yüksek kapasiteli. Buna ek olarak floresan görüntüleme, saçılma, zayıflama ve emilimi sayesinde de olsa, foton sayımı, dayanan kantitatif bir ölçüm sağlayabilir, ışık, doku büyük bir mesafe, bir teknik eksiklik nüfuz edemez. Kırmızı ya da yakın-kızılötesi ışık penetrasyon derinliğini artırmak için muhabir kullanmak için çalışmalar devam etmekte.

Floresan görüntüleme diğer bir avantajı, insan kullanımı için özel floresan muhabiri onaylanmıştır eğer klinikler çevrilebilir. Pahalı donanım ve görüntüleme ajanları gerektirmez, MR, CT, ve PET ile karşılaştırıldığında, floresan görüntüleme yüksek esnekliğe sahiptir. Bir örnek kliniklerde kullanılan floresan tabanlı endoskop ve mikro-endoskop. Floresan görüntüleme yöntemleri ile birleştirerek, biz altta yatan biyolojik süreçler ile ilgili anatomik ve fonksiyonel bilgi elde etme yeteneği elde etmek için bekliyoruz.

Z Y Yang ve Wang çalışmaları NIAMS / NIH hibe K02 AR051181 Müsküler Distrofi Derneği ve Harvard Kök Hücre Enstitüsü Y Wang için hibe ile mümkün olmuştur. , Q Zeng ve X Xu iş Brigham ve Kadın Hastanesi Optik Görüntüleme Laboratuvarı verilen bir program hibe ile desteklenmektedir. Yazarlar hücre çalışmalarına teknik yardım için Anestezi Anabilim Dalı, BWH Wen Liu teşekkür etmek istiyorum.

1. Ballou, B., L.A. Ernst and A.S. Waggoner. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12(7): 795-805 (2005).
2. Chalfie, M., Y. Tu, G. Euskirchen, W.W. Ward and D.C. Prasher. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263(5148): 802-5 (1994).
3. Godavarty, A., E.M. Sevick-Muraca and M.J. Eppstein. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32(4): 992-1000 (2005).
4. Graves, E.E., R. Weissleder and V. Ntziachristos. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4(4): 419-30 (2004).
5. Graves, E.E., D. Yessayan, G. Turner, R. Weissleder and V. Ntziachristos. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10(4): 44019 (2005).
6. Gurfinkel, M., S. Ke, X. Wen, C. Li and E.M. Sevick-Muraca. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. 19(2-3): 107-21 (2003).
7. Lee, J. and E.M. Sevick-Muraca. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19(4): 759-71 (2002).
8. Xu, X., Z. Yang, Q. Liu and Y. Wang. 2008. In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. in Annual Meeting of American Society of Gene Therapy. p. 268. Boston, MA: ASGT.
9. Hoffman, R.M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70: 121-44 (2005).
10. Coulton, G.R., J.E. Morgan, T.A. Partridge and J.C. Sloper. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14(1): 53-70 (1988).
11. Morgan, J.E. and T.A. Partridge. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35(8): 1151-6 (2003).
12. Mendell, J.R., J.T. Kissel, A.A. Amato, W. King, L. Signore, T.W. Prior, Z. Sahenk, S. Benson, P.E. McAndrew, R. Rice and et al. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333(13): 832-8 (1995).
13. Bogdanovich, S., K.J. Perkins, T.O. Krag and T.S. Khurana. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82(2): 102-15 (2004).
14. Morgan, J.E., G.R. Coulton and T.A. Partridge. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12(5): 401-9 (1989).
15. Sherwood, R.I., J.L. Christensen, I.L. Weissman and A.J. Wagers. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22(7): 1292-304 (2004).
16. Cerletti, M., S. Jurga, C.A. Witczak, M.F. Hirshman, J.L. Shadrach, L.J. Goodyear and A.J. Wagers. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134(1): 37-47 (2008).

2 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.