Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Materiali e metodi

Ceppi di lievito e le condizioni di crescita

Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto "fiasco volume / medio volume" di 5:1.

Isolamento del greggio frazione mitocondriale

1. Crescere 1 L di wild-type cultura ceppo BY4742 per 48 h.
2. Versare la cultura in 500 ml provette Nalgene. Bilanciare il carico e le cellule raccolto per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
3. Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
4. Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
5. Determinare peso fresco di pellet.
6. Risospendere le cellule in un tampone di pellet DTT [2 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
7. Trasferire la sospensione cellulare a 50 ml, tubi di plastica Falcon.
8. Ruotare le provette a 70 rpm in uno shaker per 20 minuti a 30 ° C.
9. Celle di raccolta per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
10. Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
11. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
12. Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
13. Trasferimento sospensione cellulare in un pallone di vetro.
14. Aggiungere la polvere di Zymolyase-100T [1 mg di Zymolyase-100T / g (peso fresco), le cellule] alla sospensione cellulare.
15. Ruotare il pallone con sospensione cellulare a 70 giri in uno shaker per 30 minuti a 30 ° C.
16. Sferoplasti trasferimento formata a causa della digestione della parete cellulare con Zymolyase-100T in provette di plastica da 50 ml centrifuga.
17. Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C.

** Tutti i passi successivi devono essere effettuate a 4 ° C o in ghiaccio. Sospensioni di sferoplasti devono essere trattati con delicatezza usando pipette con punte tagliate per evitare di rompere organelli .**

18. Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
19. Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C.
20. Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
21. Trasferimento alle cellule di un pre-raffreddata in ghiaccio vetro omogeneizzatore.
22. Utilizzando un pestello stretto, omogeneizzare le cellule facendo 15 colpi di pestello.
23. Aggiungere 1 volume di ghiaccio, freddo buffer di omogeneizzazione.
24. Trasferimento sferoplasti omogeneizzato in provette di plastica da 50 ml centrifuga.
25. Pellet di cellule ininterrotta, nuclei e detriti di grandi dimensioni per centrifugazione per 5 min a 1500 xga 4 ° C.
26. Centrifugare il surnatante risultante per 5 min a 3000 xga 4 ° C.
27. Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C.
28. Decantare il surnatante e risospendere pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
29. Centrifugare per 5 min a 3000 xga 4 ° C.
30. Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C.
31. Decantare il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di ghiacciata tampone SEM.

** Anche se questa sospensione è arricchita nei mitocondri, organelli contiene anche altri come il reticolo endoplasmatico (microsomi), Golgi, e vacuoli. Per ottenere i mitocondri pura, questa frazione greggio mitocondriale può essere sottoposto a ulteriore frazionamento, come descritto di seguito .**

Purificazione di mitocondri privi di contaminazione da parte di altri organuli

1. Mettere 1,5 ml di ghiacciata 60% (w / v) di saccarosio nel tampone EM in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman.
2. Sovrapposizione del 60% (w / v) con 4 ml di saccarosio del 32%, 1,5 ml del 23%, 1,5 ml di 15% di saccarosio (tutti p / v in tampone EM).
3. Mettere 3 ml della frazione mitocondriale greggio in SEM tampone sulla parte superiore del 15% (w / v) di saccarosio.
4. Centrifuga in un SW41 Beckman Ti oscillante-rotore per 1 ora a 134000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C.
5. La forma mitocondri intatti una fascia marrone al 60% / interfaccia di saccarosio 32%.
6. Rimuovere con attenzione saccarosio fino a raggiungere la band mitocondriale.
7. Rimuovere la banda mitocondriale usando una pipetta con la punta tagliata e metterla in una provetta da centrifuga di un rotore Beckman-5 MLS.
8. Riempire il tubo con tampone SEM.
9. Pellet i mitocondri puro per centrifugazione in un MLS-5 rotore per 30 minuti a 10000 xg (31000 rpm) per 30 minuti a 4 ° C.
10. Decantare il surnatante utilizzandouna pipetta.
11. Utilizzare i mitocondri pura per l'analisi delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale.

Reagenti

1. DTT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitolo] (per 15 ml)
   • 1,5 ml di buffer di 1 M Tris/H2SO4 (pH 9,4)
   • 150 ml di 1 M DTT
   • Il volume a 15 ml
2. Zymolyase tampone [20 mM di potassio fosfato (pH 7,4), sorbitolo 1,2 M] (per 100 ml)
   • 2 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,4)
   • 60 ml di 2 M sorbitolo
   • Il volume a 100 ml
3. Buffer di omogeneizzazione [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitolo, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v) di BSA] (per 250 ml]
   • 2,5 ml di 1 M Tris / HCl (pH 7,4)
   • 75 ml di 2 M sorbitolo
   • 500 microlitri di 500 mM EDTA
   • 0,5 g di BSA
   • Il volume a 250 ml
4. SEM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM saccarosio, 1 mM EDTA] (per 250 ml)
   • 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2)
   • 31,25 ml di 2 M saccarosio
   • 500 microlitri di 500 mM EDTA
   • Il volume a 250 ml
5. EM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (per 250 ml)
   • 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2)
   • 500 microlitri di 500 mM EDTA
   • Il volume a 250 ml

Questo metodo consente ad alto rendimento puro isolamento dei mitocondri da cellule di lievito. I mitocondri purificati con questo metodo sono essenzialmente priva di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione. I rendimenti metodo descritto mitocondri che sono adatti per cell-free ricostituzione di processi essenziali mitocondriale. Questi mitocondri elevata purezza può essere utilizzato anche per l'analisi della struttura e delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale.