Tissue Riktade Embryonala chimärer: Zebrafish gastrula Cell Transplantation

Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), e1422, doi:10.3791/1422 (2009).

Del 1: Alexa 594 Märkta embryon

1,1 mikroinjektion Plate och nål förberedelse

1. Göra mikroinjektion plattor
   1. Förbered injektion plattor som består av tre till fem 1-mm dalar inom ett agaros mögel med en teknik av Westerfield, 2007 ^1. Dessa dalar kommer snuggly hålla embryon i en linje för effektivt och systematiskt microinjections. Innan den plattor, ta tre 1-mm, 4-tum lång icke-glödtråden kapillärer och försiktigt bryta dem på mitten. Använda superlim, limma två av dessa 2-tums långa kapillärer sida vid sida på en plan yta. Limma den tredje kapillära ovanpå dessa två, inbäddat i lunden, vilket skapar en pyramid form med tre kapillärer. Låt torka och upprepa tills tillräckligt "botten formar" är konstruerade.
   2. Häll 20-25mL (5mm djup) av smält 1,5% agaros i embryot medium (EM) [5mm NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl _2, 0.33mM MgSO ₄ och 0,00003% metylenblått] till en 100mm petriskål. Omedelbart rum tre till fem av de tidigare gjorda pyramidformade tråg formar till botten av plattan garanterar den platta sidan av formen vidrör botten av petriskål och helt täckt av agaros.
   3. När agaret har stelnat, måste glaset kapillära formarna tas ut. För att ta bort, klippa ut en stor agarosen kvadrat som innehåller tre kapillär formar. Skaka försiktigt upp agar i utkanten av snittet torget och kasta. Vänd på torget agar bit över och, med fin pincett, helt ta bort tråget formar. Häll smälta agarosen i petriskål runt torget för att hålla den nyligen formade brunnar på plats. Låt set. Plattorna kan parafilm förseglas och förvaras i flera veckor vid 4 ° C. Kassera vid tecken på någon tillväxt i agar.
2. Nålar för microinjections.
   1. Använd en mikropipett kapillär avdragare göra nödvändiga injektionsnålar av 1-mm, 4-tums glas kapillärer med interna glödtråd. Nålar drogs med Flamming / Brun mikropipett avdragare med en värme på 550, dragkraft på 120, hastighet på 200, och en tid / fördröjning av 200.

1,2 embryosamlings-och mikroinjektion Apparatus Setup

1. Befruktade äggen omedelbart in efter att de läggs och underhålls i en petriskål fylld med EM. Injektion av fluorescerande dextraner är idealisk på en-cells scenen och bör kompletteras med den 16-cellen steg ^2.
2. Med hjälp av en bred spets glaspipett, utvisa embryon till brunnar i en rumstemperatur injektion tallrik fylld med EM. Försiktigt kil embryona i botten av tråg med knäppta trubbig pincett. Embryon som chorion eller äggula har äventyrats skall kasseras.
3. Ladda injektionsnålen med 1-2μl av utspädd fluorescerande Alexa 594 lösning (5% av vikten i 0,2 M KCl). Låt dextran att resa till toppen av kanylen genom kapillärkraften på grund av den inbäddade glödtråden kör längden på kanylen.
4. Fäst injektionsnålen på kapillär innehavaren av en stereotaktisk mikromanipulator.
5. Justera trycket på microinjector apparaten till att börja med 40-50 psi och pulslängd av 500msec.
6. Försiktigt betar toppen av kanylen till att bryta förseglingen med pincett (perfekt diameter är 0.05-0,15 mm). Med hjälp av en steromicroscope, utvisa dextran på en mikrometer med mineralolja toppen av den för att kalibrera nålen. Ändra bolus storlek genom att justera lufttrycket, duration av puls och storleken på nålspetsen. En bolus storlek motsvarande en volym av 0,8-1nl kunna bibehållas under hela injektioner ^3. Ofta tips blir igensatta med äggula partiklar, justera trycket eller bryta nålspetsen kan lindra problemet, annars en ny injektionsnål skall lastas.

1,3 Microinjections av fluorescerande Alexa 594

1. Enligt hög förstoring, med början från ena änden av tråget, smidigt genomborra chorion och cellmembranet av embryon för att komma in i gulan. Injicera dextran lösningen strax under cellen. Se till att ta bort injektionsnålen med samma mjuka rörelser används för att ange embryot. Flytta petriskål att placera nästa embryot inline och fortsätta injicera ner längden på tråget. Kontrollera trycket och bolus storlek regelbundet. Var noga med att inte flytta eller böja injektionsnålen när den är i embryot eftersom detta sannolikt kommer att dödligt skada embryot och / eller bryta injektionsnål.
2. Tryck försiktigt embryon ur tråg med pincett. Överföra dem till en petriskål fylld med antibiotika Pen / Steg EM som beskrivs i Nusslein-Volhard och Dahm (2002) (1 ml 6,5 CaCl _2, 1 ml 3.5M NaHCO _3, 25ml 20x EM och 10 ml 60mg/ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin stOck) som förberedelse för senare transplantation. Inkubera embryona vid 28,5 ° C och bildskärm för obefruktade ägg eller embryo död.

Del 2: gastrulastadium transplantationer

2,1 Dechorionating och Transplant Plate förberedelse

1. Dechorionating plattorna. Dechorionated embryon som inte har fullgjort epiboly kräver en mjuk bottenplatta för att inte få sina äggula hålla hårt på plastic.The dagen före transplantationer, med 1,5% agaroslösningen tidigare beskrivits, att dechorionating plattor genom att hälla 5 -10 mL smälta agarosen i en 100 mm petriskål. Endast ett tunt lager av agaros (2-3mm) behövs för att dämpa de embryon under dechorination. Låt svalna.
2. Transplant plattorna. Med separerade brunnar Specialized plattor måste göras enligt ^4. Häll 30 ml av 1,5% agaroslösningen i en 100mm petriskål och sätt in en transplantation och mögel. Formen bör innehålla 104 trekantiga divots varje består av tre 90 grader sidor och en 45 graders vinklad sida. Brunnarna är konstruerade för att hålla två embryon sida vid sida (bild 1A, lila ruta). Se till att inte fånga luftbubblor under formen. Låt agarosen hårdna. Ta bort formen avslöjar en nedsänkt yta innehåller torget brunnarna med en sluttande kant.

2,2 embryot och Transplant Apparatus Setup

1. Placering av givare och värd embryon
   1. Utveckling av värdar och givare måste övervakas för att bibehålla närheten åldersmatchade pairings. För att göra detta, kan embryon tas upp vid olika temperaturer (25-31 ° C) för att sakta ner eller påskynda utvecklingen respektive.
   2. Både värd och embryon Givaren skall handen dechorionated på en agar-belagd dechorionating plåt 1 timme före önskad ålder Vid gastrulastadium transplantationer detta skulle behöva vara klar 5hpf.
   3. Före sköld stadium, vid 5.5hpf värd och embryon givare lastas i en transplantation tallrik fylld med antibiotika EM. Embryon laddas in i enskilda 1-mm brunnarna med ett glas pipett. Ett exempel är följande: den första raden är fylld med donerade embryon (18 totalt, två embryon per brunn) och de följande två rader är fyllda med värd embryon (ett embryo per brunn, 9 embryon per rad).
2. Ställa in transplantationen apparaten
   1. Transplantation utförs på Zeiss Lumar fluorescerande stereo mikroskop som har helt automatiserad, joystick kontrollerad zoom och fokus manipulation. Även om transplantationer kan göras utan denna automatisering av mikroskopet den gör öka dramatiskt enkelt och effektivt, särskilt när ett stort antal transplantationer önskas.
   2. Ställ Eppendorf AirTram till mitten platsen för dess omfattning. Koppla upp AirTram (bild 1A, röd ruta) slangen till kapillär hållaren och säkra innehavaren till Eppendorf automatiserade mikromanipulator (Fig. 1A). Detta mikromanipulator är helt automatiserad och joystick kontrolleras. Återigen, detta är automatisering inte helt nödvändigt, men avsevärt förbättrar ens förmåga att navigera runt nålen och in i embryot. Alternativt, många forskare föredrar OilTram som sägs erbjuda smidigare kontroll över cellens samling, men har vi haft några problem med de AirTram.
   3. Kapillärerna använde var sterila Eppendorf TransferTips (ES) som har en 15 m avfasade öppning i spetsen och en 20 graders böjd vinkel 1 mm från spets (Fig. 1A gröna rutan).

2,3 gastrulastadium celltransplantationer

1. På 6hpf, med hjälp av mikromanipulator försiktigt betar embryot med spetsen på kapillär att rotera embryot i läge för cell extraktioner så att dess mittlinje och sköld är synliga och motsatta spetsen på kapillär. Aspirera en liten mängd EM i kapillär för att förhindra att någon chans att celler kontakta luft-vatten-gränssnitt, vilket skulle skada cellerna.
2. Baserat på zebrafisk öde kartan, med inriktning celler till framhjärnan kräver transplantation av celler vid mittlinjen exakt mellan djuret stolpen och skärmen ^5. Försiktigt hål i ektoderm av givare embryon (Rhodamine injiceras eller GFP transgena embryon) på denna plats. Tjockleken på cellerna mellan ektoderm och underliggande äggula i gastrula är tunn, och därför vara försiktig att inte spetsa äggulan, eftersom detta ofta leder till döden inom några timmar. Använda AirTram aspirera cellerna långsamt i kapillär. Alltid upprätthålla synlighet vattenlinjen. Svag agitation i spetsen medan givaren kommer att bidra till lös cell-cell kontakter. Cirka 10-50 celler från givare embryo bör extraheras innan den tas bort från embryot.
3. Ta bort kapillära från donatorn, liknande orientera värden och Pierce och utvisa de celler i exakt SAmig läge mellan djur-pol och sköld värd embryon.
4. Efter transplantation är givaren och värd embryon bort från brunnarna, separerade och försiktigt placeras på en agar bestruket petriskål fylld med antibiotika EM. Lämna embryon i transplantatet brunnar ökar dödligheten. Inkubera embryon vid 28,5 ° C.

2,4 visualisera och embryon Imaging

1. Montering fast och levande embryon.
   1. Värd embryon från transgena GFP eller Rhodamine injiceras embryon kan visualiseras och avbildat levande eller som fast embryon. Vi presenterar här exempel på både fasta och live imaging alternativ. Fix embryon offrades vid 30hpf med 4% paraformadehyde i 0,1 miljoner fosfatbuffert (PB) över natten vid 4 C ^1.
   2. Skölj embryon 2x och sedan tvätta 3 x 5 minuter i 0,1 miljoner PB.
   3. I exemplet har vi tillhandahåller, fastställdes värdar immunolabeled för alla axoner med antikroppar riktade mot Acetylerat tubulin (α-AT) som beskrivits tidigare ^6.
   4. Placera embryon i 75% glycerol, diskbänk vid rumstemperatur och sedan lagra vid 4 ° C.
   5. Förbered en bild att montera två embryon. Skapa två vaselin torget konturer i en bild som matchar insidan form och diameter av en kvadrat täckglas.
   6. Deyolk ett embryo och ett framifrån framhjärnan, dissekera bort framhjärnan genom att skära vinkelrätt över mitthjärnan. Placera denna vävnad med en minimal mängd av glycerol inom petroleum väl. Orient vävnaden i rätt läge och placera på ett täckglas över provet.
   7. Levande exemplar var monterade i en 0,75% agaroslösningen består i en 4% lösning av Tricaine (i EM) på kultur glas botten rätter. Före agaros stelnar, är embryot manipuleras med en tungsten nål för att korrekt rikta den för bildbehandling. För vår analys har vi orienterat framhjärnan direkt mot täckglas.
2. Imaging
   1. Både fasta och leva värdar var avbildas med Leica SP5 laserscanning konfokalmikroskop. Z-Stacks förvärvades och 3 - eller 4-dimensionell bildbehandling slutfördes med hjälp Volocity programvara.

Resultat:

I ett försök att ta itu roll astroglial celler i framhjärnan är det nödvändigt att både visualisera dessa celler och rikta olika genetiska manipulationer för att små grupper av diencephalic och telencephalic celler. För att generera dessa typer av chimär embryon, där någon del av astroglial befolkningen inom embryot är annorlunda vare sig genotyp eller fenotyp använde vi en mångfacetterad strategi som kombinerar användningen av GFP transgena embryon, vilka etiketter astroglia, med hjälp av gastrula -iscensatt celltransplantation. Att särskilt inrikta våra kloner till diencephalon, utnyttjade vi zebrafisk gastrula öde kartan för att selektivt utvinna celler vid mittlinjen lika långt från djuret stolpen och skärmen ⁵ (Fig. 1B). Dessa utvinns tg [GFAP: GFP] celler har sedan transplanteras till samma plats i en vild typ värd gastrula, som sedan höjdes till 30hpf och immunolabeled för alla axoner (α-Acetylerat tubulin) som referens landmärken för framhjärnan anatomi. Som ett exempel visas här, konfokal avbildning av en värd embryo avslöjar isolerade GFP + celler i hela telencephalon och diencephalon (Fig. 2A). Hela morfologi av dessa GFP + celler kan observeras i denna klonat analys, avslöjar att de flesta av dessa celler tar på den karakteristiska radiella gliaceller morfologi, där Soma ligger i anslutning till den ventrikulära zon och ett stort slutet fot avslutar en radiell process på pial yta (Fig. 2A, infälld). Tredimensionell rendering av Z-stacken i dessa samlas optiska skivor visade tydligt ställning dessa celler med avseende på den märkta axoner (Film 1).

En annan metod som ofta används för att visualisera transplanterade celler är att initialt microinject en fluorescerande färg cellsläktträd som Alexa 594, i äggulan i en en-cells arrangerade vildtyp eller GFP transgena embryo. Som ett exempel har vi injiceras Alexa 594 i vild typ embryon vid ett-cell skede. Vi tillät dem att utveckla för att skydda steg gastrula och sedan utförs framhjärnan riktade transplantation som nämnts ovan, men i stället vi transplanterade till TG [GFAP: kärn-GFP] transgena värd gastrula. Avbildning av den dorsala telencephalon av laserscanning konfokalmikroskopi avslöjade fluorescerande röda klasar av givarnas celler hos GFP + kärnor inom framhjärnan (Fig. 2B). Vi analyserade vidare denna värd genom att samla in Z-stackar var tredje minut under loppet av två timmar med laserscanning Confocal. 4-dimensionell återgivning av denna timelapse använda Volocity programvara (improvisation) visar dynamiska cellulära rörelser Rhodamine cellmembranen ennd GFP + atomkärnor (film 2).

Klicka på henne för att se en större version av figur 1.
Figur 1: Transplant apparater och schematisk av experimentella metoder. A) Apparatur som används för att genomföra gastrula steg transplantationer. Zeiss Lumar fluorescerande stereo mikroskop användes för att genomföra dessa transplantationer. Det har joystick kontrollerad fokus och zoom (vänster röd cirkel). Den Transferman NK användes för att manipulera position kapillär som också är joysticken kontrolleras (höger röd cirkel). Under installationen 60-80 embryona placeras i enskilda agar brunnar som tidigare gjorts i ett 100 mm petriskål med en plastform (lila beskrivs ruta). Transplantationen kapillära (TransferTip) tillverkas av Eppendorf har en 15μm inre diametern av öppningen och en 20 graders vinklad spets (grön beskrivs ruta). Strävan av celler styrs med Eppendorf s AirTram (röd beskrivs ruta). B) Illustration av gastrulastadium transplantation förfarande från givare till värd embryon. Celler utvinns ur TG [GFAP: GFP] embryon (visas här) eller Alexa 594 injiceras (enligt protokoll) givare embryon. Celler tas bort från mittlinjen halvvägs mellan skölden och djur pol, och transplanteras in i samma region av värd embryon. Värdar är fasta och avbildas med laserscanning konfokalmikroskopi.

Klicka här för att se en större version av figur 2.
Figur 2. Exempel på gastrulastadium transplantationer inom zebrafisk framhjärnan A) En framifrån vilda embryon typ värd med transplanterade TG [GFAP: GFP]. Celler i diencephalons och telencephalon av zebrafisk framhjärnan. Axoner är märkta i rött (α-Acetylerat tubulin antikropp) och transplanterade cellerna är märkta i grönt (endogena GFP uttryck). Embryon är 30 HPF. Infällda bilden visar radiella gliaceller morfologi av GFP + celler. B) Dorsal bild av telencephalon av levande TG [GFAP: kärn-GFP] host embryo med Rhodamine fluorescerande transplanterade celler (röd). Atomkärnor värd embryon är märkta i grönt (GFP). Streckade linjen beskriver den främre ytan av framhjärnan. Heldragna linjen visar den ventrikulära zonen. Skala bar är 10μm.

Film 1. . Förhållandet mellan ectopically märkta radiella gliaceller bland framhjärnan commissures Celler från en gastrula iscensatt TG [GFAP: GFP] embryot transplanteras till en icke-GFP transgena vildtyp linje. En laserscanning Confocal Z-Stack samlades in och bearbetas sedan för 3-D-rendering med hjälp Volocity programvara. Inledningsvis är bilden en frontal bild av zebrafisk framhjärnan på 30hpf, och det har vänt horisontellt jämfört med Figur 2B. Axoner (en-Acetylerat tubulin, röd) inom främre commissure (AC, överst) och efter optisk commissure (POC, botten) syns. Den gröna cellerna GFP + transplanterade celler som slog rot i framhjärnan och genererat tydliga radiella gliaceller morfologi. Eftersom filmen fortskrider den fokuserar på två radiella gliaceller besitter slutet avgift som kontaktar POC. Klicka här för att ladda Film 1.

Film 2. Timelapse avbildning av transplanterade Alexa Märkta 594 Celler i framhjärnan Celler från en gastrula tidigare injicerats med Alexa 594 var transplanterade till TG. [GFAP: kärn-GFP] transgena embryon. Denna film är en 3-D-projektion av en 2h timeseries, där Z-stackar togs var 5 minuter. Z-Stacks samlades in på en laserskanning konfokalmikroskop och 4-D renderingar fyllas i med Volocity programvara. Transplanterade cellerna är märkta med Alexa 594 (röd), och GFP + kärnor är gröna. Eftersom detta Timelapse körs, startar 4D bild med en rygg bild av framhjärnan på 30hpf och kommer att rotera runt X-axeln, lika tydlig rörelse detekteras i cellmembranen av alla transplanterade cellerna och i GFP + kärnor också. Klicka här för att ladda ner film 2.

Generera chimär embryon är ett kraftfullt verktyg som tar upp många frågeställningar inom flera modellsystem, nämligen bananfluga (D.melanogaster), mask (C.elegans), sebrafisk (D.rerio) och mus (M.musculus). Vi hävdar att zebrafisk modellsystem unikt är anpassat för att skapa chimärer i ett relativt enkelt, snabbt och mångsidigt sätt. Den zebrafisk är ett ryggradsdjur som utvecklas utanför moderns vilket är betydligt mer lättillgänglig jämfört med musmodell. Zebrafisk är också betydligt större än flugor eller maskar, vilket förenklar embryologiska manipulationer såsom celltransplantation. Dessutom möjliggör förmågan att kombinera förfaranden celltransplantation med transgena tekniker ett stort utbud av möjliga experiment där genfunktion kan manipuleras i en lokaliserad vävnadsspecifika sätt. Till exempel små kloner av GFP + eller Rhodamine märkta celler möjliggöra karaktärisering av hela cellen morfologier som ofta går förlorat i en homozygot transgena givare eller är omöjliga att visualisera på grund av differentiell subcellulära märkning med gemensamma antikroppar. Dessutom, genom att använda transgenically taggade eller fluorescerande fyllda celler, kan vi spåra donator celler i levande zebrafisk embryot över tiden. Timelapse avbildning av enskilda celler ger en ny analys av cellulära beteende i samband med hela organismen.

Vårt labb kombinerar också användningen av värme chock inducerbar transgena linjer med cell transplantationer som innebär att vissa axon vägledning ledtrådar kan misexpressed hos blodgivaren cellerna efter en förhöjning av inkuberingstemperatur (data inte visa). Denna teknik är en extremt kraftfull och direkt metod för att lokalt misexpress ett protein av intresse i ett rumsliga och tidsmässiga-specifika sätt, vilket tillåter oss att se hur specifikt protein påverkar utvecklingen. I vårt fall, kan denna metod utöka vår kunskap bakom funktion Slit-Robo vägledning ledtrådar i positioneringen av commissures och gliaceller vid mittlinjen ^5.

Andra metoder för att lokalt misexpressing gener som fokus UV uncaging och lokaliserad verktyg heatshock (laser eller lödkolv), erbjuder alternativa sätt att manipulera uttrycket av gener och markörer i ett litet kluster av celler ^7-9, men etablerar celltransplantation en slutgiltiga miljön i analysen som är fria från skador orsakade av UV-, laser eller värme gör celltransplantation en mer kontrollerad experimentell metod. Sammanfattningsvis har vi funnit rutiner celltransplantation att vara en viktig del av vår nervsystemets biologi forskning. Generera kloner av celler med olika egenskaper är ett viktigt verktyg för utvecklingsarbetet biologen att ta itu med grundläggande frågor av celler beteenden, geners funktion, och cell autonomi.

Vi vill tacka medlemmarna i Barresi Lab för deras stöd och värdefulla kommentarer på detta manuskript. Vi tackar Alexander Workman för hans ständiga tekniskt bistånd samt djurvård personal för deras hjälp för att upprätthålla Smith College Zebrafish koloni. Vi vill också tacka Mike Hallacy, Rudi Rottenfusser, och Carl Zeiss mikrovisualisering för utlåning några mikroskopi utrustning för filmin av detta protokoll. Detta arbete stöddes av en NSF finansierad forskning bevilja 0.615.594.

1. Westerfield, M., The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 5th ed. (University of Oregon Press, Eugene, 2007).
2. Nüsslein-Volhard, C. and Dahm, R. ed., Zebrafish, A Practical Approach. (Oxford University Press, 2002).
3. Graeden, E. and Sive, H., Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp (26) (2009).
4. Gilmour, D. T., Jessen, J.R., Lin, S., in Zebrafish, a practical approach., edited by C. and Dahm Nusslein-Volhard, R. (Oxford University Press, 2002), Vol. 1, pp. 121.
5. Woo, K., Shih, J., and Fraser, S. E., Fate maps of the zebrafish embryo. Curr Opin Genet Dev 5 (4), 439 (1995).
6. Barresi, M. J., Hutson, L. D., Chien, C. B., and Karlstrom, R. O., Hedgehog regulated Slit expression determines commissure and glial cell position in the zebrafish forebrain. Development 132 (16), 3643 (2005).
7. Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., and Weinberg, E. S., Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol 75 (5), 551 (1997);
8. Halloran, M. C. et al., Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development 127 (9), 1953 (2000);
9. Hardy, M. E., Ross, L. V., and Chien, C. B., Focal gene misexpression in zebrafish embryos induced by local heat shock using a modified soldering iron. Dev Dyn 236 (11), 3071 (2007).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.