Флуоресцентная маркировка Drosophila Структур сердца

Перед тем как начать

1. Подготовьте следующие решения:
   1. расслабляющий буфера (искусственный дрозофилы гемолимфы (АДГ) (см. "Визуализация бьющегося сердца у дрозофилы"), который содержит 10 мМ EGTA)
   2. фиксатор (4% формальдегида в 1x PBS)
   3. PBSTx (PBS, содержащего 0,1% Triton-X-100)
   4. Надлежащим разбавленный первичной и видоспецифических флуоресцентно меченых вторичных антител в PBSTx
2. Рассеките дрозофилы подвергать сердечной трубки (взрослых мух и / или личинок) после
   1. полу-дрозофилы сердце нетронутой подготовке протокола в "Визуализация бьющегося сердца у дрозофилы", или
   2. Дрозофилы личинок NMJ Dissection протокол ¹ со следующими изменениями: Используйте кислородом АДГ в личиночной рассечение и сворачивайте задний штифт немного от вентральной срединной линии. Личинки разрезать вдоль вентральной срединной линии. Не удаляйте любой ткани до фиксации.

Флуоресцентные Окрашивание

1. Убедитесь, что все сердце ритмично бьется в кислородом АДГ. Быстро заменить АДГ с расслабляющими буфера. Исследуйте каждый сердечной трубки для обеспечения сокращения подавляются.
2. Fix сердца заменив расслабляющий буфера с фиксатором. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут с осторожном встряхивании. (Для личиночной встряхивании препарата нет необходимости в какой-либо шаг, и может считаться ущерб сердечной целостности ткани).
3. Вымойте образцов три раза за десять минут с PBSTx при комнатной температуре при постоянном встряхивании.
4. Для взрослых, тщательно отделки назад вентрального края брюшной кутикулы, что то, что остается более эллиптические и менее округлый. Кроме того, с одним разрезом между брюшной полости и грудной клетки, тщательно и аккуратно отдельных обоих сегментах тела и обеспечить минимальные повреждения передней части сердца. Для личиночной сердца, тщательно удалить жир с использованием тонких щипцов. Удаление жира должна быть выполнена с особой осторожностью, так как личиночные сердца особенно хрупка и имеет очень мало поддержки со стороны других мышц или соединительной ткани. Не снимайте трахеи отрасли, как это может повредить сердце.
5. Передача отделаны грудном отделе брюшной кутикулы по краям, избегая контакта с центре города сердечной трубки, в 96 ячейках с колодцами, которые содержат 50-100 мкл первичных антител разводят в PBSTx. Место не более 12 особей на хорошо. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов при непрерывном перемешивании. Инкубационный также может быть сделано в течение ночи при 4 ° C.
6. Удалите первичный решение антител. Вымойте сердца в три раза за десять минут со 100 мкл PBSTx при комнатной температуре при постоянном встряхивании.
7. После удаления окончательного промывочный буфер, добавьте 100 мкл вторичными антителами в PBSTx, дополненные Alexa594-фаллоидином (1:1000). Инкубируйте в течение одного часа с постоянной тряски при комнатной температуре. Храните образцы покрыты для предотвращения флуорофора отбеливания.
8. После вторичного инкубации, мыть сердца в три раза за десять минут с 100 мкл PBSTx при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Храните образцы покрыты протяжении этапов промывки.
9. Для удаления Triton-X-100, промыть сердца последний раз в 100 мкл PBS в течение 10 минут. Образцы можно хранить в темном месте при температуре 4 ° С в течение нескольких дней до начала монтажа.

Монтаж для взрослых сердца

1. Соблюдайте два 18 х 18 мм скользит корки до предметное стекло микроскопа с 10 мкл Vectashield монтажа среды. Покровные стекла должны быть расположены ~ 10-15 мм друг от друга. Нанесите небольшое падение третьего монтажа среду в промежутке между двумя покровные.
2. Место 20 мкл Vectashield в центре третьего покровное.
3. Осторожно удалите каждый из сердца от промывочного раствора PBS по крайней края кутикулы и аккуратно разместить их сердца стороной вниз на каплю монтажа среды на третье покровное. Место не более пяти сердца на каплю на покровное.
4. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все сердца вниз.
5. Аккуратно переверните покровное содержащие сердца и быстро разместить его на слайд, содержащий пару покровные так, что капли с сердечным предохранители труб с каплей Vectashield между покровным пары. "Мост" должен быть сформирован на покровные стекла. Сердцах будет приостановлено между покровное и предметное стекло.
6. Проверьте под микроскопом, чтобы сердца теперь вверх.
7. Fix покровные по краям с лаком для ногтей.
8. Сердцах теперь готовы для включения в образ с помощью люминесцентных или конфокальной микроскопии.

1. Место падения (~ 20 мкл) Vectashield на предметном стекле микроскопа.
2. Тщательно передачи до двух личиночных образцов в Vectashield и ориентировать их спинной стороны вниз с помощью вольфрамовой иглы.
3. Индивидуально перетащить образцы из монтажа средних и выравнивание каждого параллельно.
4. Место покровное на противоположных сторонах образца. Использование щипцов, место 1 / 3 покровное на вершине, во-первых, заложив одну сторону на задней покровное и снижение его до передней покровное образуя мостик. Капиллярные силы вызовет поток Vectashield от задней к передней, который помогает надлежащему расположению личиночной сердце.
5. Устранены все покровные на месте, по их краям, лаком для ногтей и аккуратно заполнить пространство между покровные с 20-30 мкл Vectashield.
6. Печать с лаком для ногтей и хранить при температуре 4 ° С, или для длительного хранения при температуре -20 ° C.

Представитель Результаты

При выполнении правильно, все компоненты и связанные с ними тканей спинного сосуда должно оставаться неповрежденным и легко визуализировать. Фоновой флуоресценции должно быть минимальным. Для взрослых, вентральной продольные пятна мышечный слой очень хорошо, и производит существенный сигнал (рис. 1 и 2). Лежащий в основе круговой кардиомиоцитов однако, как правило, не производят, как интенсивный сигнал, что и вышележащих вентральный слой. Миоцитов в передней "конической палата" взрослого сердца содержат значительное количество сократительных материала и, следовательно, этот регион представляется как наиболее надежные по отношению к остальной части сердечной трубки. Личиночное сердце показывает расположение спирали миофибриллярных похож на взрослого сократительной кардиомиоцитов (рис. 3).

Рисунок 1: Top. Флуоресцентные микрофотография показывает весь сердечной трубки взрослых дрозофилы, что выражает миозина-GFP. Снимок был сделан с Zeiss Imager Z1 флуоресцентный микроскоп оснащен скользящей Apotome модуля. Миозина-GFP отображается зеленым цветом, актин окрашивается AlexaFluor ® 594 фаллоидином (красный) и α-актинина помечена с анти-α-актинина антител (синий). Обратите внимание на процедуру препаративной разрешений восстановления сердечной образцов с хорошо сохранившимися структурами. CC = конической камеры; AM = крыловидный мышцы, V = внутренний клапан; VLL = вентральный продольный слой мышц. Bottom. Области взрослого сердечной трубки из ЦК через 3-й сегмент брюшка сердца прямо под вентральной продольный слой показывающие расположение миофибрилл спирали из сократительных кардиомиоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения рисунка 1а, и здесь для большей версии рисунке 1b

Рисунок 2: Представитель конфокальной штабеля передняя часть взрослого сердце окрашивали AlexaFluor ® 594 фаллоидином (красный) и анти-Pericardin (коллагена типа IV) (зеленый) антител. Pericardin связано с сердцем вдоль брюшной поверхности, вероятно, происходящих из продольно ориентированные миофибриллы брюшной мышечный слой. Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения на рисунке 2.

Рисунок 3: флуоресцентный микрофотография сегмента А7 сердца собственно третьей стадии личинки дрозофилы. Снимок был сделан с Zeiss Imager Z1 флуоресцентный микроскоп оснащен скользящей Apotome модуля. Актина помечена AlexaFluor ® 594 фаллоидином (зеленый) и α-актинина окрашивается с анти-α-актинина антител (красный). Пожалуйста, нажмите здесь для увеличения на рисунке 3.

Здесь мы приводим протокол полезно для подготовки и окраски спинной дрозофилы судна и связанные с ними тканей для работы с изображениями с помощью люминесцентных или конфокальной микроскопии. Мы предоставляем краткий отчет о шагах уточнены и обычно используются в нашей лаборатории для эффективного окрашивания, которая позволяет хорошо разрешенных на месте изображения личинок и взрослых труб дрозофилы сердце. Другие описывали подобные методы в сокращенном виде ^{2, 3, 4.}

Важные дополнительные сведения требуют рассмотрения при реализации окрашивания процедуры. Например, как найти с другими биологическими материалами, довольно совместимый дрозофилы волокна сердечной мышцы становятся весьма хрупкими после записи. Особо следует отметить несколько пар поддержку крыловидный волокна прилагается к сердечной трубки, которые значительно тонкий ^{5, 6, 7.} Таким образом, ограничение ненужных манипуляций снижает физическое напряжение и прямой ущерб фиксированные ткани и увеличивает вероятность визуализации хорошо сохранились и в полной неприкосновенности структур. Кроме того, обращение взрослых образцов только на крайнем края кутикулы сводит к минимуму шансы на ткани возмущение.

Важно также отметить, что шаги этого протокола следует рассматривать просто как отправной точкой для успешного иммуноокрашивания личинок и взрослых дрозофил сердца. Методология сводится к минимальным количеством шагов, необходимых для реагентов широко используются в нашей лаборатории. Как и в любой иммуногистохимии протокола, определенные антитела могут потребовать различных условиях (блокирование, различным количеством моющего средства, длительное промывки и т.д.). Этот протокол может быть эмпирически оптимизированы для таких антител для удовлетворения уникальных потребностей окрашивание потенциально любая структура дрозофилы сердечной.

Изучение сердца, используя методы, описанные здесь, особенно с мощным дрозофилы является очень послушный модельной системе, что выгоды от широкого спектра хорошо развитой генетических инструментов. Эти инструменты позволяют беспрецедентную следственные власти для изучения развития, структуры и функции сердечной мышцы и ее компонентов. Например, мутационный анализ cytoarchitectural белков в сердце помог определить различные кардиомиопатии моделей в ^{8 дрозофилы, 9.} Флуоресцентная маркировка саркомерных компоненты этих моделей показало, что сердечная расширение у мух сопровождается миофибриллярных дезорганизации и потери сократительной материала. Кроме того, несколько GFP-вставки линий в настоящее время доступны ^10. Выше протокол может быть использован в сочетании с такими линиями, чтобы собрать подробную информацию о морфологических локализации и потенциальных молекулярных взаимодействий сделанные GFP с метками белков. Кроме того, генома РНК-интерференции коллекции летать линий существуют ^11, которые позволяют селективного нокдаун белка трехсторонние в сердце ^12. Наши окрашивания протокол, а затем с помощью соответствующих микроскопии, в сочетании с сердечно-нокдаун конкретных генов, представляющих интерес, позволяют тщательный анализ вклада белка в структуре сердца и функции. Вместе эти технологии позволяют мощный метод скрининга, чтобы помочь себе и расшифровать актуальность множество известных или ранее неохарактеризованных, белковые компоненты, необходимые для надлежащей сердечной морфологии и физиологии.