TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren

Voordat u begint

1. Bereid de volgende oplossingen:
   1. ontspannende buffer (kunstmatige Drosophila hemolymfe (ADH) (zie "Het visualiseren van het kloppende hart in Drosophila"), die 10 mM EGTA bevat)
   2. fixatief (4% formaldehyde in 1x PBS)
   3. PBSTx (PBS met 0,1% Triton-X-100)
   4. Juiste wijze verdund primaire en soortspecifieke fluorescent gelabelde secundaire antilichamen in PBSTx
2. Ontleden Drosophila om de cardiale buizen (van volwassen vliegen en / of larven) bloot volgende
   1. de semi-intacte Drosophila hart voorbereiding protocol in "Het visualiseren van het kloppende hart in Drosophila", of
   2. Drosophila larven NMJ Dissection protocol ¹ met de volgende wijzigingen: Gebruik zuurstofrijk ADH tijdens het larvale dissectie en iets verdringen de achterste pin uit de ventrale middellijn. Larven zijn afgesneden langs de ventrale middellijn. Verwijder geen weefsel voorafgaand aan de fixatie.

Fluorescerende kleuring

1. Controleer of alle harten zijn ritmisch kloppende in zuurstof ADH. Snel vervangen door ADH met ontspannende buffer. Onderzoek elke cardiale buis om ervoor te zorgen weeën worden geremd.
2. Bevestig de harten door het vervangen van de ontspannende buffer met een fixatief. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten onder zacht schudden. (Voor de bereiding larvale schudden is niet nodig bij elke stap, en kan worden gezien als schadelijk voor hartweefsel integriteit).
3. Was exemplaren drie keer tien minuten met PBSTx bij kamertemperatuur met voortdurende schudden.
4. Voor volwassenen, voorzichtig terugsnoeien van de ventrale randen van de buik cuticula zodanig dat wat er overblijft is meer elliptisch en minder afgerond. Bovendien, ervoor te zorgen dat een enkele cut tussen de buik en thorax, zorgvuldig en netjes gescheiden zowel lichaam segmenten en minimale schade aan het voorste deel van het hart. De larven harten, verwijder het vet lichaam met behulp van fijne pincet. Het vet verwijderen moet worden uitgevoerd met uiterste voorzichtigheid, omdat de larven hart is bijzonder kwetsbaar en heeft zeer weinig steun van andere spieren of bindweefsel. Verwijder niet de tracheale takken, dit kan de schade aan het hart.
5. Breng de bijgesneden dorsale gebied van de abdominale cuticula bij de randen, het vermijden van contact met het centraal gelegen hart-buis, in een 96 wells-plaat met putten die 50 tot 100 ul van de primaire antilichaam verdund in PBSTx bevatten. Plaats niet meer dan 12 exemplaren per well. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met voortdurende agitatie. Incubatie kan ook 's nachts worden gedaan op 4 ° C.
6. Verwijder de primaire antistof oplossing. Was de harten drie keer tien minuten met 100 ul PBSTx bij kamertemperatuur met voortdurende schudden.
7. Na verwijdering van de uiteindelijke wasbuffer, voeg 100 ul van secundaire antilichaam in PBSTx, aangevuld met Alexa594-phalloidin (1:1000). Incubeer gedurende een uur met een voortdurend schudden bij kamertemperatuur. Houden monsters afgedekt om te voorkomen fluorofoor bleken.
8. Volgende secundaire incubatie, was de harten drie keer tien minuten met 100 ul van PBSTx bij kamertemperatuur met voortdurende schudden. Houd de monsters bedekt de hele wasstappen.
9. Voor het verwijderen van Triton-X-100, spoel de harten een laatste keer in 100 ui PBS gedurende 10 minuten. De monsters kunnen worden opgeslagen in het donker bij 4 ° C gedurende enkele dagen voor de montage.

Montage voor volwassenen Hearts

1. Houden twee 18 x 18 mm dekglaasjes op een objectglaasje met 10 ul van Vectashield montage medium. De dekglaasjes moeten ~ 10-15 mm van elkaar worden uit elkaar geplaatst. Plaats een kleine derde druppel van montage medium in-tussen de twee dekglaasjes.
2. Plaats 20 ul van Vectashield in het centrum van een derde dekglaasje aan.
3. Verwijder voorzichtig elk van de harten van de PBS-wasoplossing door de uiterste randen van de nagelriem, en zachtjes leg ze hart-kant naar beneden op de daling van montage medium op de derde dekglaasje aan. Plaats niet meer dan vijf harten per druppel op het dekglaasje.
4. Controleer onder een microscoop om te zorgen dat alle harten naar beneden.
5. Voorzichtig omkeren dekglaasje met de harten en snel te plaatsen op de dia met de twee dekglaasjes zodanig dat de druppel met een hart-buizen zekeringen met de Vectashield druppel tussen het dekglaasje paar. Een "brug" dient te worden gevormd door de dekglaasjes. De harten zal worden geschorst tussen een dekglaasje en de microscoop dia.
6. Controleer onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de harten zijn nu naar boven gericht.
7. Fix coverslips op hun randen met nagellak.
8. De harten zijn nu klaar om te worden afgebeeld via fluorescentie of confocale microscopie.

1. Plaats een druppel (~ 20 ul) Vectashield op een microscoopglaasje.
2. Zorgvuldig tot transfer naar twee larvale specimens in de Vectashield en oriënteren ze dorsale zijde naar beneden met behulp van wolfraam naalden.
3. Individueel Sleep de modellen van de montage medium en lijn elk in parallel.
4. Plaats een dekglaasje op de tegenover elkaar liggende zijden van het monster. Met behulp van een tang, een derde plaats dekglaasje op de top, eerst door het leggen van de ene kant op de achterste dekglaasje en het verlagen van het naar beneden aan de voorste dekglaasje en vormen zo een brug. Capillaire krachten zal leiden tot een stroom van Vectashield van posterior naar anterior, die een goede uitlijning van de larvale hart helpt.
5. Fix alle dekglaasjes op zijn plaats, op hun randen, met nagellak en zorgvuldig vullen de ruimte tussen de dekglaasjes met 20-30 ul Vectashield.
6. Afdichting met nagellak en bewaren bij 4 ° C, of ​​voor langdurige opslag bij -20 ° C.

Representatieve resultaten

Wanneer correct uitgevoerd, moeten alle onderdelen en de bijbehorende weefsels van het dorsale vat blijven intact en worden direct gevisualiseerd. De achtergrond fluorescentie moet minimaal zijn. Voor volwassenen is de ventrale longitudinale spierlaag vlekken zeer goed en levert een substantiële signaal (Figuur 1 en Figuur 2). De onderliggende ronde cardiomyocyten echter de neiging niet te produceren zo intens een signaal als dat van de bovenliggende ventrale laag. De myocyten van de voorste "kegelvormige kamer 'van het volwassen hart bevatten een aanzienlijke hoeveelheid contractiele materiaal en, bijgevolg, deze regio verschijnt als de meest robuuste ten opzichte van de rest van de cardiale buis. De larvale hart toont een spiraalvormige myofibrillar regeling vergelijkbaar met die van de volwassen contractiele cardiomyocyten (figuur 3).

Figuur 1: Top. Een TL-microfoto met de hele cardiale buis van een volwassen Drosophila melanogaster dat myosine-GFP uitdrukt. Het beeld werd gemaakt met een Zeiss Imager Z1 fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verschuifbare apotome module. Myosine-GFP is in het groen, actine wordt gekleurd met AlexaFluor ® 594 phalloidin (rood) en α-actinine is voorzien van anti-α-actinine antilichaam (blauw). Let op de voorbereidende procedure het mogelijk maakt om het hart monsters met goed bewaarde structuren. CC = kegelvormige kamer; AM = Alary spieren; V = interne ventiel; VLL = ventrale longitudinale spierlaag. Bottom. Een gebied van de volwassen hart los van de CC door de 3e buik segment van het hart net onder de ventrale longitudinale laag van de spiraalvormige myofibril rangschikking van de contractiele cardiomyocyten. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1a, en hier voor een grotere versie van figuur 1b

Figuur 2: Vertegenwoordiger confocale stapels van een voorste deel van het volwassen hart gekleurd met AlexaFluor ® 594 phalloidin (rood) en een anti-Pericardin (collageen type IV) (groen) antilichaam. Pericardin wordt geassocieerd met het hart langs het ventrale oppervlak, waarschijnlijk afkomstig van de lengterichting georiënteerde myofibrillen van de ventrale spierlaag. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2.

Figuur 3: Een TL-microfoto van het segment A7 van het hart goed van een derde fase Drosophila larven. Het beeld werd gemaakt met een Zeiss Imager Z1 fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verschuifbare apotome module. Actine is voorzien van AlexaFluor ® 594 phalloidin (groen) en α-actinine is gekleurd met anti-α-actinine antilichaam (rood). Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 3.

Hier presenteren wij een protocol nuttig voor het opstellen en kleuren van de Drosophila melanogaster dorsale vat en de omliggende weefsels voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Wij bieden een beknopt verslag van de stappen verfijnd door en algemeen gebruikt in ons lab voor effectieve kleuren die goed opgelost vergunningen in situ beeldvorming van larven en volwassen Drosophila hart buizen. Anderen hebben soortgelijke methoden beschreven in verkorte vorm ^{2, 3, 4.}

Belangrijke aanvullende informatie nodig hebben gehouden bij de uitvoering van de kleuringsprocedure. Bijvoorbeeld, zoals gevonden bij andere biologische materialen, de vrij compliant Drosophila hart spiervezels weer heel broos na fixatie. Van bijzonder belang zijn de verschillende paren van ondersteunende Alary vezels verbonden aan het hart buis, die aanzienlijk delicate ^{5, 6, 7.} Dus, om de onnodige manipulatie vermindert de fysieke belasting en directe schade aan de vaste weefsel en het verhoogt de kans op het visualiseren van goed bewaard gebleven en volledig intact structuren. Verder, de behandeling van de volwassen monsters slechts aan de uiterste randen van de cuticula minimaliseert de kans op verstoring weefsel.

Het is ook essentieel om op te merken dat de stappen van dit protocol moet worden beschouwd als simpelweg een uitgangspunt voor een succesvolle immunokleuring van larven en volwassen Drosophila harten. De methodiek wordt gereduceerd tot het minimum aantal stappen die nodig zijn voor de reagentia vaak gebruikt in ons laboratorium. Net als bij elke immunohistochemie protocol, kunnen bepaalde antilichamen vereisen verschillende omstandigheden (blocking, variabele hoeveelheden van wasmiddel, langdurige wasstappen, etc.). Dit protocol kan dus empirisch worden geoptimaliseerd voor dergelijke antilichamen aan de unieke behoeften van potentieel vlekken elke Drosophila cardiale structuur te voldoen.

Het bestuderen van het hart met behulp van de hier beschreven technieken is bijzonder krachtig, omdat Drosophila melanogaster is een zeer handelbaar model systeem, dat profiteert van een breed scala van goed ontwikkelde genetische tools. Deze tools maken ongeëvenaarde onderzoeksbevoegdheid aan de ontwikkeling, structuur en functie van de hartspier en de componenten ervan te bestuderen. Zo heeft mutatie-analyse van cytoarchitectural eiwitten in het hart heeft geholpen om een verscheidenheid aan cardiomyopathie modellen in Drosophila ^{8, 9.} TL-etikettering van de sarcomeer componenten van deze modellen is gebleken dat cardiale dilatatie in vliegt gaat gepaard met myofibrillar desorganisatie en een verlies van contractiele materiaal. Bovendien, meerdere GFP-insertie lijnen zijn op dit moment beschikbaar ^10. Het bovenstaande protocol kan gebruikt worden in combinatie met dergelijke lijnen naar gedetailleerde morfologische informatie met betrekking tot de lokalisatie en de mogelijke moleculaire interacties van GFP-gemerkte eiwitten te verzamelen. Bovendien, genoom-brede RNAi collecties van vliegen lijnen bestaan ​​er ¹¹ dat selectieve knock-down van eiwit bestanddelen toe in het hart ^12. Onze kleuringsprotocol, gevolgd door geschikte microscopie, in combinatie met de cardiale-specifieke knockdown van genen van belang, zodat een zorgvuldige analyse van de bijdrage van een eiwit aan het hart structuur en functie. Samen vormen deze technieken maken een krachtige screeningsmethode te visualiseren en het ontcijferen van de relevantie van een groot aantal bekende, of eerder gekarakteriseerde, eiwit-componenten die nodig zijn voor een goede cardiale morfologie en fysiologie te helpen.