Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

Parte 1: Two-dimensional eletroforese em gel (2-D), utilizando taça de carregamento

1. IPG strip-reidratação e focalização isoelétrica (IEF)
   • Reidratar géis DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) em 125 mL de solução de reidratação [7 M uréia, 2 M tiouréia, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampão pH 6-11] usando a bandeja DryStrip Immobiline Reswelling para pelo menos 10 horas.
   • Dissolver amostra de proteína precipitado em IEF tampão de amostra [7 M uréia, tiouréia 2 M, CHAPS 2%, 2% ASB-14, hydroxyethyldisulfide mM 50 e 2% IPG tampão pH 6-11] correspondente a 60-100 mg de proteína por 100 ml .
   • Após solubilização (pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente), aplicar amostra de proteína via anódica xícara de carga, utilizando copos de amostras. O volume do copo é de 100 l (cups Manifold permitem até 150 mL).
     Nota: você pode carregar grandes quantidades de amostra, se você inserir um passo de baixa tensão no início do protocolo de foco e encher os copos enquanto ainda há uma película de líquido no copo!
   • Realizar focalização isoelétrica para 11,1 KVH no modo gradiente na Unidade de Eletroforese Multiphor II.
2. Equilíbrio e SDS-PAGE
   • Depois IEF, as tiras IPG foram submetidos a uma redução e alquilação, cada tempo de 15 minutos em um agitador, usando ditiotreitol 1% e 2,5% respectivamente iodoacetamida em solução de equilíbrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M de uréia, glicerol 30% e 2% SDS].
   • Lave as tiras equilibrada com H ₂ O e exterminá-los em papel Whatman para remover excesso de tampão de equilíbrio. Depois mergulhar as tiras em SDS-tampão de corrida (1X).
   • Segunda dimensão é realizada por SDS-PAGE em um sistemas de eletroforese vertical, com uma concentração de acrilamida total de 12%. As tiras IPG foram equilibradas colocados no topo dos géis de separação e fixados com solução de agarose quente [agarose 0,5% em tampão de corrida contendo azul de bromofenol].
   • Proteínas foram separadas por 2,5 horas, a partir de 80 V por 15 minutos, seguida de 120 V até a frente de corante atinge o fundo da gaveta gel.

Parte 2: coloração Coomassie coloidal com CBB G-250

1. Soluções de coloração
Nota: para a preparação das soluções de coloração, utilize produtos químicos com alta qualidade, tais como grau analítico (pa) e água de alta pureza como você começa a partir Millipore sistemas (água Milli-Q).

Nota: para a preparação da solução de coloração, a adição seqüencial dos componentes na seguinte ordem tem de ser mantido:

1. dissolver primeiro sulfato de alumínio em água Milli-Q
2. depois adicionar etanol, homogeneizar e mix CBB G-250 para a solução
3. recentemente, a solução é totalmente dissolvido, acrescentar ácido fosfórico (a incorporação do ácido para a mídia alcoólicas permite que as moléculas de Coomassie agregar em seu estado coloidal)
4. finalmente, encher com água Milli-Q

Nota: a solução de coloração final tem uma aparência verde-azulado escuro e está cheio de partículas de natação ao redor:

• Não filtrado esta solução!
• Se você alterou a ordem de preparação, você teria uma solução mais violeta-azulada que é menos sensível.

2. Processo de coloração

• Após a separação segunda dimensão, remova cuidadosamente os géis das placas de vidro e transferi-los para um prato cheio de coloração água Milli-Q.
• Lave o gel três vezes com água Milli-Q por 10 minutos em um agitador horizontal (lavagem insuficiente causa sensibilidade pobres porque a SDS restante no gel perturba o delimitadora do corante à proteína).
• Agitar a solução Coomassie antes do uso para dispersar as partículas coloidais uniformemente.
• Incubar o gel bem coberto com a solução de Coomassie por agitação em um agitador de 12/02 horas. Esta coloração gera marginais de fundo para que você possa observar o progresso coloração no meio.
  Nota: após 10 minutos você pode ver manchas primeira proteína que aparece, dentro de 2 horas de incubação de cerca de 80% da coloração a elas nível máximo é concluída. Por quase 100% de coloração, a incubação durante a noite é recomendado. Em alguns casos, quando a quantidade de proteína a ser manchado é enorme ea solução se transforma em um azul brilhante, uma atualização da solução de coloração é necessário.
• Após o procedimento de coloração remover a solução Coomassie e lavar o gel duas vezes com água Milli-Q.
  Nota: você pode reutilizar a solução de coloração, desde que as partículas são ainda remanescentes, caso contrário, descarte-o (lembre-se que o seu laboratório pode ter regras especiais para a eliminação de resíduos).
• Remover partículas de corante degola do prato com uma coloração que não solte fiapos toalha de papel e destain para 10-60 minutos.
  Nota: Você também pode lavar o gel apenas com água Milli-Q, mas isso recomendamos apenas para preparativa géis porque não vai durar um irregular, o filme de Coomassie fraco no gel que irão surgir durante o processo de digitalização.
• Finalmente lavar o gel duas vezes com água Milli-Q: o gel chegará a sua espessura original (a mídia álcool-ácido faz o encolhimento géis) e neutralização em água, adicionalmente, aumenta a intensidade de cor Coomassie.

Parte 3: Os resultados representativos

Se você seguir o protocolo descrito acima, você receberá em seu gel 2-D distintas e bem resolvida manchado manchas escuras proteína azul. Mesmo comparado a um gel 2-D corados com prata de acordo com Shevchenko et al. ^5, um protocolo alegando boa sensibilidade e compatibilidade com espectrometria de massa, conseguimos resultados de coloração igual.

Figura 1: Resultado das experiências descritas acima. Coomassie Kang protocolo (A) realiza fortemente como a coloração pela prata de acordo com Shevchenko et al. (B) na detecção de proteínas após o 2-D eletroforese em gel.

Parte 4: Dicas e truques

• Executar algumas colorações teste antes de processar suas próprias amostras. Por razões inexplicáveis, por vezes, nós informamos que uma proteína de interesse não pode ser detectado com sucesso, mesmo quando miligramas foram aplicados. Neste caso, recomendamos a preparar algumas séries de diluição para teste de sensibilidade.
• Se você tem baixa em gel de detecção da proteína (s) na transferência, em geral mal sucedidas do empilhamento para o gel de separação durante a SDS-PAGE será possivelmente a razão. Você pode verificar essas proteínas adesivas através da coloração do gel completo, incluindo a área de empilhamento.
• Para uma verificação rápida dos seus resultados com foco isoelétrico, você pode diretamente mancha as tiras IPG, sem qualquer separação outra dimensão segundo.
• Ocasionalmente, por sua vez o gel durante o procedimento de coloração para que eles sejam manchadas por igual de ambos os lados (se você manter o gel imóvel, o corante liga-se a apenas um lado do gel).
• Fizemos a experiência de que o armazenamento da solução de coloração em uma garrafa escura aumenta sua vida útil (em garrafas transparentes até 4 meses).
• Após a coloração e documentar você pode manter o gel na geladeira por vários anos (se você adicionar solução ácida a evitar contaminações por fungos).
• Descoloração de plugues gel para uma digestão tríptica pode ser acelerado pelo aquecimento em um aquecedor de bloco.

Inovadora ou apenas outro protocolo Coomassie?

No momento existem vários protocolos para a coloração de procedimentos com Coomassie Brilliant Blue. A maioria deles o resultado de modificações maiores ou menores de um dos protocolos mais comumente usados ​​por Neuhoff e colegas ^2. Também protocolo Kang é baseado na fórmula de Neuhoff. Mas é realmente um método de coloração Coomassie alternativa para a pesquisa proteômica? Vamos imagem duas questões principais, limite de detecção e usabilidade, a evidência de que ele é definitivamente um protocolo de coloração benéfico em comparação com outros protocolos Coomassie e colorações mesmo de prata e fluorescentes.

Foco I: limite de detecção

Na publicação Kang, eles detectaram várias proteínas marcadoras até 1 ng / banda (figura 2). Mas, em nossa opinião, um limite de detecção de 4-8 ng / banda é mais provavelmente relacionados com a prática (tabela 1). Eles também discutiram os níveis de sensibilidade superior em relação a ambos uma Coomassie coloidal protocolo com CBB G-250 em ácido fosfórico, sulfato de amônio e metanol, e uma coloração pela prata ácidas (Silver Stain Além disso Kit) da Amersham Pharmacia Biotecnologia.

Figura 2: Representante SDS-gel publicado por Kang et al. que demonstra o poder de as modificações no protocolo CBB-G250. 250 ng / banda proteínas foram carregadas no mais à esquerda e 2 vezes diluído para o lado direito consecutivamente.

Tabela 1: Coloração limites para as proteínas convencionais tomadas a partir da publicação Kang em comparação a um limite mais realista para a detecção da proteína.

Para confirmar esses limites de detecção e para continuar a validar o método de Kang coloração realizamos nossa série de testes próprios em comum Laemmli SDS-géis com marcadores de peso molecular detectado pelo comercialmente disponíveis soluções de coloração fluorescente, como Sypro Ruby (BioRad) e Deep Purple (GE Healthcare) (figura 3). Curiosamente, graus de marcação Kang o bem ou mesmo melhor desempenho (no caso do Deep Purple) e é, portanto, definitivamente superior em termos de contribuição de trabalho e desempenho!

Figura 3: Comparação da coloração da CBB Kang-G250-based (A) com Sypro Ruby (B) e Deep Purple (GE Healthcare) (figura 3). (C) de coloração de bandas de proteínas em SDS-PAGE. Um marcador de peso molecular contendo fosforilase b (97,4 kDa), BSA (66,2 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (31 kDa), inibidor de tripsina de soja (21,5 kDa) e lisozima (14,4 kDa) foi analisada, com quantidades de proteína de 1 g / banda no lado esquerdo do gel e consecutivamente diluída duas vezes para a direita.

No entanto, esses limites de detecção foram determinados com proteínas padrão usado para os marcadores de peso molecular e deve ser considerada com cautela. Por esta razão, adicionalmente sujeitos método de Kang coloração com proteínas diferentes que, em parte, têm afinidade de ligação fraca para CBB (por exemplo, fetuína, mycin). Conforme demonstrado na figura 4, protocolo Kang é superior à coloração CBB convencionais e até funciona melhor do que Sypro Ruby, mas não vem até a coloração de prata neste caso. No entanto, acreditamos que o método de Kang coloração modificada é uma alternativa excelente para a detecção da proteína sensível e rápido em gel com base em proteômica.

Figura 4: manchas de proteína de fetuína com (A) protocolo de Coomassie Kang coloidal (sem descoloração) em comparação com (B) um convencional CBB G-250 coloração (40% de metanol e 10% de ácido acético), (C) Sypro Ryby e (D ) coloração pela prata de acordo com Shevchenko et al. Quantidades de proteína de 2 g diluído até 2 ng foram carregados para SDS-PAGE.

Foco II: usabilidade
Ao lado dos limites de detecção melhorada faz Coomassie Kang protocolo oferecer vários recursos que torna preferencial para o colorações de Neuhoff ou Candiano e protocolos, mesmo de fluorescência:

• fixação e coloração é feita em uma única etapa
• não mais de 4 etapas em todas as
• resultados são rápidos primeira coloração visível (na maioria dos casos em menos de 20 minutos)
• o procedimento requer apenas duas horas para 80% de conclusão da coloração
• somentecoloração de fundo mínimo
• o procedimento de coloração é muito reprodutíveis (é um método de ponto final)
• não mais lidar com álcool tóxicos (metanol é substituído pelo etanol)
• a solução é quase inodoro (sem uso de ácido acético)
• uso da CBB G-250 em baixas concentrações.

Em resumo, a fórmula é bastante conveniente, relativamente não perigosos ambiente, simpático e barato. Além disso coloração Kang é totalmente compatível com análises de espectrometria de massa. No final pode-se dizer que a coloração Coomassie Kang é excelente para um rápido e analítico de detecção em gel de proteínas, mesmo para as abordagens baseadas proteômica.