LAD-Legatura: un modello murino di infarto miocardico

Topi BALB / c per un peso minimo di 20 g in età da 8 a 12 settimane sono acquistati da Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld).
I topi sono alloggiati in condizioni convenzionali, alimentati pellet del mouse standard e acqua ad libitum. Anestetizzare mouse con isoflurano (2%) con una camera di induzione.

1. Radere la zona del collo e il lato sinistro della gabbia toracica e disinfettare con l'80% di etanolo.
2. Posizionare il mouse sul dorso e posto una maschera sul suo naso e la bocca per mantenere l'anestesia.
3. Verificare i riflessi pizzicare la coda e le zampe posteriori per essere sicuri che il mouse è sufficiente anesthesized.
4. In vista microscopico eseguire una incisione mediana che separa la cervicale, i muscoli della pelle e tessuto che copre la trachea.
5. Quando la trachea è esposto tagliare un piccolo foro nel tessuto tra due anelli cartuccia di sotto della glottide per inserire il tubo endotracheale (Figura 1). Inserire il tubo endotracheale tenendo la parte craniale della trachea utilizzando micro forecepts chirurgico. Controllare il movimento del torace per essere sicuri che entrambi i polmoni sono ben ventilato.
6. La frequenza respiratoria (RR) dovrebbero essere circa 110 al minuto, con una pressione inspiratoria di 17 a 18 centimetri H ₂ O. Girare il mouse con cura, situata sul lato destro, verso il lato sinistro. Eseguire una toracotomia leftsided tra ^il 3 e il 4 ^° costola, e sezionare il tessuto muscolare e con attenzione, usando un Cauter per prevenire le emorragie.
7. Aprire il torace con attenzione, una volta che il torace è aperto, trovare il cuore, senza toccare il polmone con oggetti appuntiti. Ora rimuovere la parte del sacco pericardico che copre il cuore.
8. Il LAD si trova tra l'arteria polmonare e l'atrio sinistro. Utilizzare un Prolene 8-0 sutura (Ethicon, Norderstedt) per legare la LAD prossimale con una sutura singola (Figura 2).
9. Posizionare un drenaggio toracico (28G, catetere venale), tra ^il 4 e il 5 ^° costola.
10. Chiudere l'incisione del torace in strati, con 6-0 punti di sutura Prolene esecuzione (Ethicon, Norderstedt, Germania) per adattare le costole e suture Prolene 4-0 in esecuzione (Ethicon, Norderstedt, Germania) per chiudere la pelle.
11. Scolate il torace con l'aiuto di una siringa da 2 ml con cura (Figura 3). Posizionare il mouse sul dorso. Ora prendete il tubo endotracheale e adeguare le anelli tracheali con una sola cartuccia punto singolo con 7-0 punti di sutura Prolene (Ethicon, Norderstedt, Germania).
12. Posizionare la maschera del mouse e chiudere la pelle con Prolene 4-0 esecuzione suture (Ethicon, Norderstedt, Germania).

Validazione

Ci sono diverse possibilità di confermare il successo della LAD-legatura.

Il test della troponina può essere eseguito 6 a 18 ore dopo l'intervento chirurgico, usando soltanto 150 litri di sangue, senza la necessità di eutanasia degli animali. Il sangue viene applicata a un kit personalizzato di test della troponina (T TROP sensibili, Roche, Mannheim) (Figura 4). Troponina è una proteina regolatrice della filamenti di actina della cellula muscolare, ci sono isotipi differenti nei tre tipi di muscolo. La cTnI e cTnT isotipi si trovano nel cuore e sono uscito nel danno tissutale. Il test standardizzato per la troponina T (cTnT) si basa su due specifici anticorpi monoclonali cuore, uno trappole della troponina nel campione di sangue, il secondo è un indicatore.

La zona infartuata può essere identificato macroscopicamente dopo 3 giorni (Figura 5).

TTC (2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro) colorazione dei tessuti misure di viabilità per valutare dimensioni dell'infarto. Evans colorante blu (1,5%, 1,0 ml) in tampone fosfato salino (PBS) viene iniettato nella cavità ventricolare sinistra per misurare l'area del miocardio ischemico. Il mouse è eutanasia e il cuore viene raccolto e sezionato in fette. Le fette di tessuto sono incubati in 1% di soluzione di TTC PBS, pH 7,4 a 37 ° C per 20 min. I tessuti sono fissati nel 10% PBS-formalina tamponata durante la notte a 2-8 ° C. TTC viene somministrato ex vivo per la tintura blu di Evans-negativi aree (Figura 6).

Per istologia il mouse deve essere eutanasia e il cuore deve essere integrato per ulteriori elaborazioni. Dopo l'esecuzione di sezioni di paraffina, le diapositive sono macchiati con H & E (ematossilina e eosina) o tricromica di visualizzare tessuto fibrotico (Figura 7).

Figura 1: tubo tracheale.
1A: Esposto trachea, dopo ventrale incisione cervicale.
1B: Trachea è aperto due anelli di cartilagine caudale alla laringe.
1C: tubo tracheale viene inserito nella trachea.

Figura 2: Il cuore è esposto attraverso una toracotomia sinistra lato, il ragazzo è legato.

Figura 4: Due linee appaiono dopo pochi minuti quando il test della troponina positivo.

Figura 5: mostra il cuore espiantato.
5A: vista macroscopico del cuore con l'area ischemica con un colore sbiadito biancastro.
5B: Sezione del cuore infartuato, l'area ischemica mostra in alto a destra.

In sintesi, questo video visualizza la LAD-legatura modello passo-passo e identifica LAD-legature nei topi, come gli interventi chirurgici facilmente realizzabile.