The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Department of Structural and Molecular Neuroscience, McLean Hospital, 2Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 3Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center
Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. W. Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (30), e1444, doi:10.3791/1444 (2009).
हम बेहतर अस्थायी गाइरस में एक प्रकार का पागलपन रोगियों में देखा ग्रे मामले में कमी की जांच परत III में जीन पिरामिड न्यूरॉन्स की अभिव्यक्ति प्रोफाइल पूछताछ द्वारा प्रस्ताव रखा. यह सर्वविदित है कि प्रमस्तिष्क प्रांतस्था एक असाधारण विविध क्षेत्रों, परतों और प्रकार की कोशिकाओं, जिनमें से प्रत्येक का अलग सेलुलर और आणविक रचनाओं और इसलिए अंतर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल द्वारा विशेषता है जिसमें विषम संरचना है. ऊतक विविधता के confounding प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, हम लेजर कब्जा microdissection (LCM) का इस्तेमाल किया है ताकि हमारे विशेष सेल प्रकार यानी पिरामिड न्यूरॉन्स को अलग.
लगभग 500 पिरामिड Histogene धुंधला समाधान के साथ दाग न्यूरॉन्स Arcturus XT LCM प्रणाली का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. आरएनए तो कब्जा कर लिया कोशिकाओं से अलग किया गया था और T7 आधारित रैखिक प्रवर्धन Arcturus / आण्विक डिवाइसेज किट का उपयोग कर के दो राउंड लिया. Experion (जैव रेड) LabChip जेल और electropherogram अच्छी गुणवत्ता एक प्रतिलेख पिछले प्रोटीन के लिए आवश्यक 600nt विस्तार लंबाई के साथ एक शाही सेना (एम) ने संकेत दिया. प्राप्त mRNA की राशि 51μg औसत स्वीकार्य मतलब नमूना पवित्रता के साथ के रूप में 2.5 के A260/280 अनुपात, ने संकेत दिया है. जीन अभिव्यक्ति मानव Affymetrix से X3P GeneChip जांच सरणी का उपयोग profiled गया था.
1) ऊतक सेक्शनिंग:
हम हार्वर्ड मस्तिष्क के ऊतकों संसाधन केंद्र से आवश्यक ऊतक (नियंत्रण n = 9, एक प्रकार का पागलपन n = 9) प्राप्त की, उम्र, लिंग और शवपरीक्षा अंतराल (PMI) (तालिका 1) के लिए मिलान. तरल नाइट्रोजन वाष्प ब्लॉक लगभग 3mm मोटी Brodmann 42 क्षेत्र (बेहतर अस्थायी गाइरस) से ले जाया गया था.
पिरामिड न्यूरॉन्स की धुंधला शुरू करने से पहले, शर्तों के क्रम में इष्टतम ऊतक "लिफ्ट" और उच्च शाही सेना गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. "लिफ्ट" ऊतक लेजर कब्जा microdissection प्रक्रिया के दौरान, जहां कब्जा करने के लिए चिह्नित न्यूरॉन्स टोपी का पालन कर रहे हैं और अलग जबकि शेष ऊतक पीछे छोड़ दिया है का वर्णन करता है.
अनुकूलन:
हम पहले से निर्धारित किया है कि पिरामिड के न्यूरॉन्स के लिए, मामले के अनुसार 500 कोशिकाओं क्रम में माइक्रोएरे संकरण के लिए पर्याप्त शाही सेना अधिग्रहण पर्याप्त हैं. लगभग चार वर्गों मामले के अनुसार की जरूरत है मुख्य कारण कलाकृतियों सेक्शनिंग और धुंधला हो जाना.
2) पिरामिड न्यूरॉन्स की धुंधला:
पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान Histogene जल्दी धुंधला समाधान और किट के साथ हासिल की है, के रूप में यह हमें इन न्यूरॉन्स की कल्पना करने के लिए, जलीय समाधान के लिए लंबे समय तक निवेश के बिना, जिससे शाही सेना के संरक्षण की अनुमति देता है.
धुंधला कदम केवल अगर तुरंत बाद लेजर पर कब्जा किया जाना चाहिए. सभी समाधान हर 4-6 स्लाइड्स परिवर्तित किया जाना चाहिए क्रम में प्रदूषण को रोकने के लिए और उचित निर्जलीकरण सुनिश्चित.
3) सिंगल सेल लेजर कब्जा microdissection:
धुंधला के बाद, परत III से पिरामिड न्यूरॉन्स लेजर कब्जा microdissection का उपयोग कर हटा रहे हैं Arcturus XT प्रणाली और सॉफ्टवेयर के साथ. संक्षेप में, सिस्टम एक थर्माप्लास्टिक फिल्म के माध्यम से एक टोपी के आधार पर स्थित एक समायोज्य शक्ति IR लेजर स्पंदन / ब्याज की कोशिकाओं पर सीधे विस्तार बढ़ाव फिल्म में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा काम करता है. जब टोपी ऊतक से उठाया है, कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया / टोपी पर कैद रहते हैं. एक सचित्र सारांश चित्रा 1 में दिया जाता है.
इस प्रक्रिया शुरू करने से पहले, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए इस प्रणाली के साथ उपलब्ध टोपी के दो प्रकार के बीच अंतर. है जबकि मैक्रो CapSure टोपी आम तौर पर बड़े ऊतकों संरचनाओं पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, CapSure एच एस टोपी के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं के छोटे संख्या पर कब्जा करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं और इसलिए इन टोपियां एक छोटे सतह पर कब्जा के लिए नामित क्षेत्र है. एच एस टोपियां भी पटरियों है कि ऊतक अनुभाग के साथ सीधे संपर्क में किया जा रहा से टोपी को रोकने के है, जबकि मैक्रो टोपी नहीं करता है. इन पटरियों ऊतक तह है कि प्रभावित या स्थान आकार की परिवर्तनशीलता लेजर पल्स () प्रेरित हो सकता है के रूप में मैक्रो टोपी मुड़ा, असमान ऊतक पर सीधे बैठता है के प्रभाव को कम. हमारे प्रक्रिया के लिए, हम एच एस टोपियां का इस्तेमाल उनके ऊतक तह के प्रभाव को कम करने की क्षमता का लाभ ले लो, लेकिन सॉफ्टवेयर पर मैक्रो टोपी सेटिंग्स रखा क्रम में कब्जा कर लिया क्षेत्र को अधिकतम करने के रूप में हम कक्षों की एक बड़ी संख्या पर कब्जा कर रहे हैं.
अब हम शक्ति और लेजर पल्स अवधि को समायोजित क्रम में पिरामिड न्यूरॉन पर कब्जा है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में यह कब्जा कर लिया कोशिकाओं की संख्या के अलावा में कब्जा कर लिया सेल की विशिष्टता को निर्धारित करता है. यदि नाड़ी भी कमजोर है नहीं सभी पहचान न्यूरॉन्स कब्जा हो जाएगा, जबकि अगर नाड़ी भी मजबूत है यह / ऊतक अकेले न्यूरॉन के अलावा अन्य कोशिकाओं के आसपास पर कब्जा कर सकता है. आम तौर पर, ऊतकों और सेल यहाँ कार्यरत विनिर्देशों के साथ, लेजर शक्ति (70mW) और 25μm की एक स्थान आकार में अवधि परिणाम (16msec) पिरामिड न्यूरॉन आकार के साथ लाइन में लगभग (छवि 1B). हालांकि, इन सेटिंग्स को प्रत्येक अनुभाग के लिए ठीक है देखते हैं क्रम में करने के लिए मामले के अनुसार मोटे तौर पर एक ही स्थान आकार प्राप्त. यदि "लिफ्ट" समझौता किया है, एक हमेशा पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि क्रम में शाही सेना की राशि प्रत्येक तुलनीय मामले से प्राप्त रखने के लिए कर सकते हैं. हालांकि, धुंधला सहित 1.5 घंटे के तहत अपने कब्जे समय, इस की तुलना में अब के रूप में शाही सेना गुणवत्ता में समझौता कर सकते हैं रखने के लिए सुनिश्चित हो.
4) विशिष्ट neuronal आबादी से शाही सेना को प्राप्त करने:
एक अलगाव के लिए पर कब्जा करने से सीधे चलते हैं, कर सकते हैं या -80 ° सी फ्रीजर में संग्रहीत नमूना पिघलना. हमारे प्रयोग में, हम पहले अलगाव शाही सेना आगे बढ़ने से पहले सभी आवश्यक और -80 में उन्हें संग्रहीत नमूनों ° सी एकत्र.
आरएनए अलगाव PicoPure अलगाव किट है, जो LCM नमूनों से कोशिकाओं के छोटे संख्या को अलग करने और कम बहुतायत mRNA बनाए रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है का उपयोग किया जाता है. आम तौर पर, हम प्रोटोकॉल का पालन करें कि किट के साथ शामिल है. नीचे, हम इस प्रक्रिया का एक बुनियादी विवरण दे.
गुणवत्ता नियंत्रण बहुत महत्वपूर्ण है जब शाही सेना अलग, खासकर जब मात्रा में छोटा है, और जरूरत जैसे माइक्रोएरे प्रयोगों (15μg) के लिए, राशि, बड़े है. इसलिए निकाला शाही सेना प्रक्रिया भर में विभिन्न समय बिंदुओं पर गुणवत्ता नियंत्रण से गुजरना चाहिए. निकासी के बाद पहली होता है. हम electropherograms और आभासी Experion HighSens LabChip द्वारा उत्पन्न जेल की 18S/28S चोटियों के सकल परीक्षा के माध्यम से कुल शाही सेना अखंडता की स्थापना. इस विधि जल्दी है और मापन के दो मतलब है गुणवत्ता electropherogram और एक आभासी जेल (छवि 2) शाही सेना की जांच प्रदान करता है. यदि कुल शाही सेना की गुणवत्ता अपेक्षाकृत अच्छा (चित्र. 2A, बी बनाम सी, डी), हम तो रैखिक mRNA, जो कुल शाही सेना के लगभग 2% के लिए खातों amplifying के साथ आगे बढ़ना.
5) रैखिक प्रवर्धन:
लेजर कब्जा कर लिया ऊतकों से निकाली गई शाही सेना के प्रवर्धन के लिए आवश्यक है क्रम में बाद माइक्रोएरे संकरण और QRT-पीसीआर प्रयोगों के लिए एक शाही सेना के एक पर्याप्त राशि का उत्पादन है. आदेश में संभावित T7 आधारित रैखिक प्रवर्धन के साथ उल्लेख किया घालमेल कर दिया है की संभावना को कम करने के लिए, हम शुरू लेजर कब्जा कर लिया ऊतक सामग्री की राशि को अधिकतम द्वारा आवश्यक प्रवर्धन के दौर की संख्या कम से कम.
हमारे प्रारंभिक डेटा (नहीं दिखाया गया है) बताते हैं कि कुल ऊतकों कि लगभग 500 कोशिकाओं होते से निकाले शाही सेना के रैखिक प्रवर्धन (RiboAmp एचएस PLUS किट) के दो दौर ARNA के लगभग 50μg उत्पादन होगा - दोनों माइक्रोएरे और QRT-पीसीआर के प्रदर्शन के लिए पर्याप्त प्रयोगों. यदि संभव हो तो, 0.2ml और 0.5ml ट्यूबों के बीच थर्मल cycler और 0.5ml किट में दिए गए ट्यूबों में 0.5ml ब्लॉक का उपयोग करके नमूना के अनावश्यक स्थानांतरित से बचने.
फिर, बाद प्रोटोकॉल एक किट के साथ प्रदान की है. यहाँ एक संक्षिप्त संस्करण में वर्णित है.
शाही सेना रैखिक प्रवर्धन के दूसरे दौर की प्रक्रिया (अलग प्राइमरों के साथ - किट प्रोटोकॉल देखें), जिसके बाद और अधिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम कार्यरत हैं. नमूना के एक उल लगभग mRNA प्रतिलेख और StdSens LabChip (Experion) के साथ लंबाई एकाग्रता का निर्धारण 250ng/ul पतला है. पारंपरिक Affymetrix माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी mRNA लंबाई में कम से कम 600 nucleotides करने के क्रम में पता लगाया जा आवश्यकता है. जेल और electropherogram LabChip से प्राप्त इसलिए इस न्यूनतम mRNA प्रतिलेख लंबाई (3 छवि) का वर्णन करना चाहिए.
एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण है, जहां एक दो ऑप्टिकल घनत्व, यानी A260 और A280 बना अनुपात, शाही सेना शुद्धता निर्धारित करता है के माध्यम से निर्धारित किया जाता है. 2.1 चारों ओर एक ऑप्टिकल घनत्व के साथ नमूने जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए लेबल किया जाना चाहिए, हालांकि 2.7 करने के लिए ऊपर अनुपात करने के लिए तुलनीय संकरण गुणवत्ता है दिखाया गया है. एकाग्रता भी 800ng/μl-1μg/μl के बीच होना चाहिए, क्योंकि इस से कम जबकि भंडारण में गिरावट शाही सेना (-80 ° C से नीचे तापमान पर भी) का नेतृत्व किया गया है और भी गरीब माइक्रोएरे परिणाम के लिए नेतृत्व.
6) बायोटिन लेबलिंग Affymetrix माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए mRNA के नमूने:
आण्विक उपकरण से टर्बो बायोटिन लेबलिंग किट (अंत लेबलिंग) प्रवर्धित नमूनों से प्राप्त ARNA लेबल के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल का एक छोटा संस्करण यहाँ दी गई है.
ARNA तो संकरित और जीन अभिव्यक्ति profiled, Affymetrix से मानव X3P GeneChip जांच सरणी का उपयोग कर. इस चिप के रूप में और अधिक अपमानित ARNA के लिए डिजाइन किया गया था, हम यह एक एहतियात के रूप में इस्तेमाल किया, के रूप में कई कारकों हम नियंत्रित नहीं कर सकते शवपरीक्षा ऊतकों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. जैसा कि हमारे प्रयोगशाला संकरण के लिए पर्याप्त सुविधाएं नहीं था, प्रक्रिया भागीदार के लिए जीनोमिक कोर सुविधा पर प्रदर्शन किया गया था.
प्रतिनिधि परिणाम:
सेक्शनिंग 1 +2 +3) ऊतक, पिरामिड न्यूरॉन्स और लेजर कब्जा microdissection के धुंधला हो जाना:
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल दो स्लाइड्स में स्लाइड प्रति चार वर्गों के साथ परिणाम चाहिए. प्रत्येक अनुभाग न्यूनतम फाड़, खुर और तह के साथ चिकनी किया जाना चाहिए. सही धुंधला के साथ, लगभग 20 दाग अंधेरे में दाग पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान करेगा - एक पिरामिड आकार और दृश्य शिखर dendrites के साथ आकार में 25μm. अनुभाग / कुल शाही सेना के कम से कम 500pg में जिसके परिणामस्वरूप मामले प्रति 700 कोशिकाओं - मैक्रो सेटिंग्स पर CapSure एचएस टोपियां, और लेजर शक्ति और प्रत्येक अनुभाग के लिए ताकत का सही समायोजन के साथ, आप 500 के आसपास प्राप्त करना चाहिए. लगभग 85 - न्यूरॉन्स की 100% टोपी (1 छवि) का पालन करना होगा.
4) विशिष्ट neuronal आबादी से शाही सेना को प्राप्त करने:
के रूप में कुल शाही सेना के अलगाव के बाद वर्णित है, हम electropherogram और जैव रेड Experion के माध्यम से आभासी जेल के माध्यम से शाही सेना गुणवत्ता की जांच. Electropherogram में, आप दो अलग चोटियों 18s और 28S ribosomal शाही सेना इकाइयों को इसी देखना चाहिए. शवपरीक्षा ऊतकों के साथ, तथापि, यह हमेशा मामला नहीं है, के रूप में ऊतक अपमानित सेक्शनिंग करने के लिए कारकों की वजह से पहले किया जा सकता है. आप सामान्य रूप से 18s के चारों ओर एक बड़ी चोटी है, और एक छोटे 28S चोटी (छवि 2A, बी) के साथ एक बड़ी टक्कर के संकेत गिरावट देखेंगे. के रूप में लंबे समय के रूप electropherogram प्रोफाइल नमूने भर में तुलना कर रहे हैं, हम इस निर्देश में पाया गया है mRNA काफी अच्छा प्रदर्शन करने के लिए दोनों RT-पीसीआर और माइक्रोएरे पढ़ाई (Imbeaud एट अल., 2005) गुणवत्ता में परिणाम.
अगर वहाँ बहुत अधिक गिरावट है - के रूप में electropherogram की वक्र के तहत एक बड़े क्षेत्र से संकेत दिया है, या अगर चोटियों दिखाई नहीं कर रहे हैं (छवि 2C, डी) - कोशिकाओं ऊतकों से फिर से कब्जा कर लिया जाना चाहिए. हम भी पहले कोशिकाओं वापसी के लिए तय है कि ऊतक ब्लॉक ही पदावनत है एक परीक्षण ऊतक परिमार्जन, जहां शाही सेना अनुभाग (न सिर्फ कोशिकाओं) के पूरे टुकड़े से निकाला जाता है कर की सिफारिश करेगी.
5) रैखिक प्रवर्धन:
रैखिक प्रवर्धन के दो राउंड के बाद mRNA की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए, हम दोनों जैव रेड Experion StdSens LabChip और NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग किया. पारंपरिक Affymetrix माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी mRNA लंबाई में कम से कम 600 nucleotides के क्रम में पता लगाया जा, जो इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया गया था करने की आवश्यकता है है. वास्तव में, mRNA लंबाई 1000 nucleotide रेंज में पाया गया. electropherogram भी बड़े चोटियों धीरे धीरे समय के एक समारोह (छवि 3A, बी) के रूप में उतरते के साथ इस दर्शाता है.
NanoDrop रीडिंग नमूने भर A260/A280 अनुपात 2.5 के औसत का संकेत है, व्यवहार्य mRNA (तालिका 2) का संकेत है.
हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि इस प्रोटोकॉल के साथ, दोनों मात्रा और शाही सेना की गुणवत्ता प्राप्त Affymetrix मानव X3P GeneChip के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति मतभेद पूछताछ काफी अच्छा है.
6) बायोटिन लेबलिंग Affymetrix माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए mRNA के नमूने:
Affymetrix मानव X3P GeneChip संकरण के बाद, हम 26.6% (तालिका 2) के एक औसत के प्रतिशत कॉल हासिल की है, पर्याप्त संकरण और जांच तीव्रता का संकेत है.
तालिका 1: पलटन सारांश
| नमूने | समूह | लिंग | आयु | PMI |
| C1 | नियंत्रण | एफ | 79 | 15.00 |
| C2 | नियंत्रण | एम | 22 | 21.47 |
| C4 | नियंत्रण | एम | 75 | 20.25 |
| C5 | नियंत्रण | एम | 80 | 15.50 |
| C6 | नियंत्रण | एफ | 58 | 21.08 |
| C8 | नियंत्रण | एम | 61 | 17.00 |
| C10 | नियंत्रण | एफ | 71 | 20.50 |
| C11 | नियंत्रण | एफ | 12.66 | |
| C12 | नियंत्रण | एफ | 86 | 6.92 |
| मतलब | 4M/5F | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | एफ | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOPH. | एम | 55 | 21.40 |
| S3 | SCHIZOPH. | एफ | 67 | 21.80 |
| S4 | SCHIZOPH. | एफ | 55 | 22.00 |
| S5 | SCHIZOPH. | एम | 36 | 17.97 |
| S6 | SCHIZOPH. | एम | 62 | 10.75 |
| S8 | SCHIZOPH. | एफ | 92 | 17.80 |
| S11 | SCHIZOPH. | एम | 56 | 21.83 |
| S12 | SCHIZOPH. | एफ | 88 | 13.33 |
| मतलब | 4M/5F | 68.11 | 16.90 |
लघुरूप: एफ - पुरुष PMI - महिला, एम शवपरीक्षा अंतराल, schizoph. - एक प्रकार का पागलपन.
तालिका 2: परिणामों का सारांश आरएनए एकाग्रता, गुणवत्ता, और संकरण दक्षता चित्रण
| नमूने | [MRNA] एनजी / उल | A260/A280 | जांच तीव्रता | प्रतिशत कॉल |
| C1 | 1318.01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2312.93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1811.92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1316.26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1663.24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633.05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994.24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817.23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2560.88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2169.61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2067.32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1563.89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| S5 | 2071.44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| S6 | 2532.59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2189.22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1669.89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1739.35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| मतलब | 1708.75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
चित्रा 1: लेजर कब्जा microdissection प्रक्रिया का सारांश ए) पिरामिड न्यूरॉन्स आकृति विज्ञान की पहचान कर रहे हैं. बी) के बाद लेजर थर्माप्लास्टिक फिल्म के माध्यम से स्पंदित है, कोशिकाओं टोपी पालन इसलिए कर रहे हैं और अब कोई स्लाइड पर, आसपास के ऊतकों को छोड़ने के पीछे. सी) एक सजातीय सेल की आबादी का photomicrograph लेजर पर कब्जा करने के बाद CapSure कैप पर पालन.
चित्रा 2: कुल शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण A + B) अलगाव के बाद अच्छी गुणवत्ता कुल शाही सेना का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि सी + डी) दिखाता कुल शाही सेना के अलगाव के बाद की तरह नहीं दिखना चाहिए. ए) (बी) में आभासी जेल के साथ स्पष्ट 18/28S इसी चोटियों के साथ एक electropherogram. सी) एक electropherogram वक्र के तहत एक बड़े क्षेत्र को दिखा रहा है और कोई 18S/28S शाही सेना गिरावट का संकेत चोटियों. यह भी आभासी जेल (डी) में दिखाया गया है.
चित्रा 3: mRNA गुणवत्ता नियंत्रण ए + बी) (ए) Electropherogram और आभासी जेल (बी) का संकेत mRNA प्रतिलेख लेंग(प्रसार) वें माइक्रोएरे अध्ययन के लिए आवश्यक है, यानी पिछले 600 nucleotides (NT) का विस्तार. सी + डी) (सी) Electropherogram और आभासी जेल (डी) दिखा रहा है क्या पसंद है, एक अपर्याप्त mRNA प्रसार mRNA प्रतिलेख लंबाई के रूप में पिछले 200nt विस्तार नहीं करता है देखना होगा.
यहाँ, हम विषम शवपरीक्षा मस्तिष्क ऊतक Arcturus XT प्रणाली और संबंधित शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर से सजातीय सेल आबादियों को निकालने के लिए अनुकूलित करने के लिए एक प्रोटोकॉल करने का प्रयास. जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, हम कुछ संशोधनों के मूल कंपनी द्वारा उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल के लिए बनाया है, क्रम में आरएनए अखंडता को अधिकतम. एकल कक्षों के सफल कैप्चरिंग कदम पहले अनुकूलन पर कब्जा करने के लिए आदेश में अच्छा शाही सेना के साथ अधिकतम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पर पूरी तरह निर्भर करता है. इन चरणों विभिन्न सेक्शनिंग और धुंधला ऊतक के साथ जुड़े मानकों में शामिल हैं. संक्षेप में, ऊतक तैयारी के संबंध के साथ इन में शामिल हैं: 1) तापमान ढाल कम जब, 2 सेक्शनिंग) केवल स्लाइड प्रति 2 वर्गों, 3) रखने बर्फ पर सभी निर्जलीकरण कदम प्रदर्शन, 4) दाग 5, RNase अवरोध करनेवाला जोड़ने) बढ़ती अंतिम 100% 3 मिनट के लिए इथेनॉल में निर्जलीकरण की अवधि.
के साथ संबंध है पर कब्जा करने के लिए, हमें लगता है कि मैक्रो सेटिंग पर सॉफ्टवेयर के साथ CapSure एचएस टोपियां, के संयोजन इष्टतम परिणाम यह सुनिश्चित करना चाहिए. नमी नियंत्रित वातावरण पर कब्जा एकल कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में उच्च आर्द्रता काफी ऊतक "लिफ्ट" कम कर देता है. उच्च तापमान भी शाही सेना गुणवत्ता पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है.
PicoPure किट के साथ शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान, वहाँ दो धोने कदम उठाए हैं. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए जाँच लें कि सभी धोने बफर आरएनए elution के लिए दूसरे microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले हटा दिया जाता है, अपने अंतिम नमूना में बफर के किसी भी उपस्थिति के प्रवर्धन के लिए कम शुरू शाही सेना के रूप में परिणाम होगा. यह सुनिश्चित करने के लिए, हम 2.5 के बजाय मिनट से 2 मिनट के रूप में प्रदान की गई प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है के लिए अंतिम धोने कदम अपकेंद्रित्र.
अधिकांश भाग के लिए, रैखिक प्रवर्धन प्रोटोकॉल के निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था. हालांकि, दो महत्वपूर्ण अंक खाते में लिया जाना चाहिए जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग: 1) ट्यूबों के बीच, केवल 0.5ml थर्मल cycler में एक 0.5ml ब्लॉक के साथ संयोजन के रूप में प्रदान की ट्यूबों का उपयोग करके नमूनों की अतिरिक्त स्थानांतरित माध्यम से शाही सेना के नुकसान को सीमित करने की कोशिश , और 2) जब सीडीएनए की शुद्धि के लिए शुद्धि स्तंभ के लिए नमूना हस्तांतरण, पहली स्थानांतरण के बाद नीचे नमूना ट्यूबों स्पिन करने के लिए सुनिश्चित हो. यह एक अतिरिक्त 1 शुद्धि स्तंभ जोड़ सकते हैं और इसलिए सीडीएनए वसूली में वृद्धि कर सकते हैं नमूना के 2ul में परिणाम देगा.
जब टर्बो किट अंत लेबलिंग के बायोटिन अपने सीमित ARNA नमूनों की लेबलिंग के लिए इस्तेमाल कर रही है, हम बताते हैं एक अतिरिक्त कुछ μl जोड़ने centrifugation कदम से पहले पानी की है, को बढ़ाने के लिए लेबल शाही सेना स्तंभ से निकाले उपज. Centrifugation के एक अतिरिक्त मिनट भी इस संबंध में मदद करेंगे, खासकर अगर आप FFPE ऊतक के रूप में अपमानित ऊतक, के साथ काम कर रहे हैं.
हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता heterogenous शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर एक सेल आबादी, जैसे छोटे सजातीय संरचना, को अलग करने के लिए सक्षम हो जाएगा लगता है. यह आसपास के ढांचे और अन्य सेल प्रकार मस्तिष्क के भीतर विभिन्न परतों में स्थित के कमजोर पड़ने प्रभाव, जांच के तहत विशेष सेल प्रकार की ओर लक्षित परिणामों के लिए अग्रणी को कम कर देता है. परिणामस्वरूप शाही सेना की गुणवत्ता के रूप में माइक्रोएरे अध्ययन के लिए काफी अच्छा है, हम विशेष सेल रोग राज्यों में प्रभावित आबादी के विशिष्ट आणविक हस्ताक्षर तुच्छ शुरू कर सकते हैं.
इस वीडियो लेख के उत्पादन जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा प्रायोजित किया गया था.
हम कृतज्ञता आण्विक उपकरण उनके अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के उदार दान के लिए विश्लेषणात्मक प्रौद्योगिकियों / Arcturus को स्वीकार करते हैं. RO1MH76060 और P50MH080272: हम भी शवपरीक्षा मानव मस्तिष्क के ऊतकों प्रदान करने के लिए हार्वर्ड ऊतक संसाधन केंद्र अनुदान धन्यवाद..
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
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ReplyPosted by: ShwetaAugust 29, 2009, 6:00 AM