The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Stemgent, 2Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology
Hamilton, B., Feng, Q., Ye, M., Welstead, G. G. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System. J. Vis. Exp. (33), e1447, doi:10.3791/1447 (2009).
Usando um conjunto definido de fatores de transcrição e as condições de cultura de células, Yamanaka e seus colegas demonstraram que retrovírus mediada entrega e expressão de Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4 é capaz de induzir pluripotência em fibroblastos de rato 1. Relatórios subseqüentes têm demonstrado a utilidade da doxiciclina (DOX) induzível sistema de entrega lentiviral para a geração de células primárias e secundárias iPS a partir de uma variedade de outros adultos do mouse tipos de células somáticas 2,3.
Pluripotentes induzidas da haste (iPS) são semelhantes às células-tronco embrionárias (ES) células em proliferação, morfologia e capacidade de induzir a formação de teratoma. Ambos os tipos de célula podem ser usados como material de partida para pluripotentes a geração de células diferenciadas ou tecidos em medicina regenerativa. 4-6 células iPS também têm uma vantagem distinta sobre células-tronco embrionárias como eles apresentam propriedades-chave das células-tronco embrionárias sem o dilema ético de destruição de embriões.
Aqui demonstramos o protocolo para a reprogramação embrionárias de rato de fibroblastos (MEF), as células com o induzível DOX Stemgent Set rato TF Lentivirus. Nós também demonstramos que a Stemgent induzível DOX Mouse Set Lentivirus TF é capaz de expressar cada um dos quatro fatores de transcrição em cima de transdução em MEFs induzindo um estado de células-tronco pluripotentes que exibe os marcadores de pluripotência característica de células ES.
Estes resultados demonstram que a Stemgent DOX induzível Mouse Set Lentivirus TF pode ser usado para gerar de forma eficiente iPS colônias por induzir a expressão ectópica de transduzidas fatores de transcrição em fibroblastos do ratinho embrionárias. Ao projetar experimentos reprogramação, diversas variáveis devem ser considerados para otimizar a eficiência de reprogramação. Primeiro, é possível modificar a relação célula ativa do vírus em relação ao objectivo (ie MOI) durante a etapa de infecção primária para aumentar ou diminuir a eficiência de transdução, afectando assim o número de vírus integrado na população celular alvo. Segundo, ajustando o tempo de as células são expostas a DOX pode afetar a eficiência de geração de iPS colônia de células. Terceiro, a capacidade proliferativa das células-alvo pode ter impacto reprogramação, as células que estão crescendo ativamente e dividindo são mais passíveis de reprogramação. Por último, ao modificar o protocolo de número de células diferentes ou diferentes tamanho pratos de cultura de tecido, é recomendado que os números de célula-alvo ser ajustado proporcionalmente à área da superfície da placa de cultura.
O autor, Brad Hamilton, é empregado por Stemgent que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set | Stemgent | 00-0003 |
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ReplyPosted by: Angelo PorciunculaMarch 21, 2010, 6:29 AM